HPLC测定不同厂家发酵型茶叶中阿魏酸含量

陈锦，胡茂丰，文欣，吴章华，刘素纯，5*

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙410128；2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙410128；3.湖南省食品质量监督检验研究院，湖南长沙410128；4.长沙市调料食品工程技术研究中心，湖南长沙410000；5.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128）

HPLC测定不同厂家发酵型茶叶中阿魏酸含量

陈锦1，胡茂丰2，文欣3，吴章华4，刘素纯1，5*

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙410128；2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙410128；3.湖南省食品质量监督检验研究院，湖南长沙410128；4.长沙市调料食品工程技术研究中心，湖南长沙410000；5.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128）

采用高效液相色谱法测定不同厂家发酵型茶叶中阿魏酸的含量，色谱条件为Shimpack VP-ODS C18（150 mm×6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为0.2%冰醋酸-甲醇（28∶72），检测波长314 nm，柱温30℃，流速1.0 mL/min。结果表明，阿魏酸在20～100 μg/mL范围内线性良好（相关系数R2=0.999 8），平均加样回收率为98.73%，相对标准偏差（RSD）为1.71%。测得9个厂家不同发酵型茶叶中阿魏酸的含量在22.559～30.286 μg/g，其中湖南益阳的湘益茯砖茶阿魏酸含量最高，为30.286 μg/g。该方法简便快速，适用于发酵型茶叶中阿魏酸含量的测定。

阿魏酸含量；发酵型茶；高效液相色谱；检测条件

发酵型茶是中国传统茶类之一，生产历史悠久，早在11世纪前后就有有关于茶蒸制成团块，堆积20多天使其变色的记载，因其独特的品质风味，深受人们喜爱。微生物在其渥堆过程中起到关键作用，GREENWALT C J等[1]研究表明，经微生物发酵后的茶比绿茶具有更高的生物活性，这种活性主要来源于酚酸类物质。阿魏酸是桂皮酸的衍生物，是普遍存在的一种酚酸，具有抗氧化[2]、抗血栓[3]、降血脂[4]、抗菌消炎[5]以及抗突变防癌[6]等功能。其含量测定方法的报道有很多，主要有气相色谱法[7]、薄层显色扫描法[8]、紫外分光光度法[9]及高效液相色谱法[10]。但目前，国内外大多研究集中在茶叶中没食子酸[11]、原儿茶酸[12]、咖啡酸[13]、芦丁[14]等，少见发酵型茶中阿魏酸含量测定的相关文献报道。本实验就提高阿魏酸的稳定性及高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定阿魏酸含量的方法进行了探讨，并用HPLC法测定了不同厂家生产的不同的几种典型发酵型茶中阿魏酸的含量，并进行比较分析，为发酵型茶叶中阿魏酸含量的质量控制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茶叶样品为市场购买的黑毛茶，中药粉碎机粉碎过100目筛后备用；茯砖茶、普洱茶、青砖茶3种茶叶各选3个不同茶厂生产的产品作为测定的样品，中药粉碎机粉碎过100目筛后，备用。

甲醇（色谱纯）、冰醋酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；水为超纯水；其他试剂均为国产分析纯；阿魏酸标样：上海紫一试剂厂。

1.2 仪器与设备

Waters 2695高效液相色谱仪、Waters 2996二级管阵列检测器、Empower色谱工作站：美国Waters公司；FW135中药粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；BCD-206BD电冰箱：青岛海尔有限公司；TE214S分析天平：长沙康源科技开发有限公司；CF-RXⅡ离心机：日本日立公司；pHS-3E pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；SB120D超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的制备

称取茶叶样品粉末（过100目筛）约0.2 g，于10 mL容量瓶中，用体积分数为70%的甲醇加至刻度，超声（40 kHz、120 W）提取30 min，静置。取上清液过0.45 μm滤膜，取滤液进样。

1.3.2 标准溶液的制备

称取阿魏酸对照样品1 mg于250 mL棕色容量瓶中，用体积分数为70%的甲醇加至刻度，超声（40 kHz、120 W）提取30 min，静置。取上清液过0.45 μm滤膜，取滤液进样。

1.3.3 色谱条件

Shimpack VP-ODS C18（150 mm×6 mm，5 μm）色谱柱，流动相选用0.2%冰醋酸-甲醇（28∶72）[11]，流速1mL/min，检测波长314 nm，柱温30℃，进样量10 μL。

2 结果与分析

2.1 测定条件的选择

文献报道中高效液相色谱法测定阿魏酸含量多用体积分数为70%、50%的甲醇、体积分数为70%、50%的乙醇等作为溶剂[11]，样品制备方法的筛选中，对比了4种溶剂对样品中阿魏酸的提取，结果用体积分数为70%的甲醇提出的阿魏酸最为完全，因此确定用体积分数为70%的甲醇作溶剂，但因阿魏酸不稳定，容易分解，对照品溶液及样品溶液配制后，应存放于棕色试剂瓶中避光低温保存，且须当天配制。阿魏酸对照品溶液在190～400 nm波长范围内进行紫外光谱扫描，结果表明，阿魏酸在波长314 nm处吸收灵敏度最高，因此选用314 nm为检测波长。

2.2 阿魏酸标准曲线绘制及含量测定

标品及样品高效液相色谱图见图1。吸取质量浓度分别为20 μg/mL、40 μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL对照品溶液进行色谱测定，按上述色谱条件测定峰面积，以阿魏酸含量（x）对峰面积（y）制作标准曲线见图2，得回归方程：y=0.727x+0.019 2，相关系数R2=0.999 8。结果表明，阿魏酸质量浓度在20～100 μg/mL间与峰面积有良好的线性关系[16]。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

按照样品测定方法，精密吸取上述阿魏酸标准溶液，重复进样5次，每次进样量10 μL，结果（见表1）可知，检测结果相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.46%，＜5%，表明仪器精密度良好[16]。

2.3.2 重复性试验

精密称取茶叶样品（过100目筛）约2.0 g（6份），按1.3.1制备样品溶液，测定阿魏酸含量，结果见表2。由表2可知，检测结果RSD为1.67%，＜5%，表明该检测方法重现性好[16]。

2.3.3 稳定性试验

精密吸取同一样品溶液，进样量10 μL，分别测定阿魏酸的含量，结果见表3。由表3可知，检测结果RSD为1.59%，＜5%，表明样品溶液在8 h内稳定。

2.3.4 加样回收率试验

取茶叶样品约0.1 g共6份，于10 mL容量瓶中，加入阿魏酸对照品20 μg，加体积分数为70%的甲醇至刻度，超声30 min静置，取上清液过0.45 μm滤膜，取滤液，进样10 μL，按上述色谱条件测定阿魏酸含量，分别计算回收率，结果见表4。

由表4可知，检测结果所得平均回收率为98.73%，RSD=1.71%，＜5%，表明该方法准确度高。

2.3.5 样品提取的条件选择

称取样品茶叶粉末（过100目筛）约0.4 g于10 mL棕色容量瓶中（3份），用体积分数为70%的甲醇稀释至刻度，分别超声（40 kHz，120 W）提取10 min、20 min、30 min，静置。取上清液过0.45 μm滤膜，取滤液，色谱检测条件下进样10 μL，检测阿魏酸含量，结果见表5。

由表5可知，超声提取10 min未将阿魏酸提取充分，超声提取20 min较好，与30 min含量没有明显变化，因此，选用超声提取20 min。

2.4 样品中阿魏酸含量的测定

不同茶厂具有各自独立的生产线与发酵环境，同一厂家的茶类产品成分大致相近，因此本研究选择不同茶厂较具代表性的一种发酵型茶叶产品作为研究对象。茯砖茶、青砖茶、普洱茶3种茶叶各选3个不同茶厂生产的产品作为测定的样品，中药粉碎机粉碎过100目筛后，备用。每个样品取2.0 g左右，按1.3.1制备样品溶液，进样10 μL，检测阿魏酸含量，结果见表6。

由表6可知，产于湖南益阳的茯砖茶，阿魏酸含量最高30.286 μg/g，产于云南的普洱茶阿魏酸含量略低为25.762 μg/g，产于湖北的青砖茶阿魏酸含量最低为22.559 μg/g，其含量比湖南益阳的茯砖茶低25.3%，可见不同产地厂家的发酵型茶叶中阿魏酸的含量差异很大，可能是由原料及制备工艺的差异引起的。

3 结论

本试验确定了发酵型茶叶中阿魏酸的HPLC最佳检测条件为Shimpack VP-ODS C18色谱柱（150 mm×6 mm，5μm），流动相选用0.2%冰醋酸-甲醇（28∶72）[11]，流速1 mL/min，检测波长314 nm，柱温30℃，进样10 μL。并在上述条件下进行了仪器精密度试验RSD=1.46%、重复性试验RSD=1.67%、稳定性试验RSD=1.59%、加样回收率试验RSD=1.71%，均证明试验的可行性良好。在此基础上，进行测定各个地区不同厂家发酵型茶的茶叶样品中阿魏酸的含量，测定结果表明产于湖南益阳的茯砖茶阿魏酸含量最高为30.286 μg/g，不同产地厂家的发酵型茶叶中阿魏酸的含量差异很大，可能是由原料及制备工艺的差异引起的，具体原因有待进一步探讨。对不同产地不同差价的发酵型茶叶中阿魏酸的含量进行比较对完善发酵型茶叶的质控体系具有重要意义，茶叶中阿魏酸的具体含量评价标准有待进一步研究。

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CHEN Jin1,HU Maofeng2,WEN Xin3,WU Zhanghua4,LIU Suchun1,5*
(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 3.Hunan Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research,Changsha 410128,China; 4.Changsha Seasoning Food Engineering Technology Research Center,Changsha 410000,China; 5.Hunan Key Laboratories of Food Science and Biotechnology,Changsha 410128,China)

The ferulic acid contents of fermented tea from different manufacturers were determined by HPLC.The separation was performed on Shimpack VP-ODS C18column(150 mm×6 mm,5 μm)with 0.2%glacial acetic acid-methyl alcohol(28∶72)as mobile phase.Ferulic acid was detected at 314 nm with flowing rate 1.0 ml/min at 30℃.The calibration curve was linear(R2=0.999 8)in the range of 20-100 μg/ml for ferulic acid.The average recovery was 98.73%and relative standard deviation was 1.71%,respectively.The ferulic acid contents of fermented tea from 9 manufacturers were 22.559-30.286 μg/g,and the ferulic acid content in Xiangyi brick tea was the highest of 30.286 μg/g.The method was quick and convenient for ferulic acid determination for fermented tea.

ferulic acid content;fermented tea;HPLC;determination conditions

O657.7

A

0254-5071（2015）04-0161-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.037

2015-03-17

湖南省科技计划项目（2012NK3072）

陈锦（1989-），女，硕士研究生，研究方向为营养与食品卫生学。

*通讯作者：刘素纯（1966-），女，博士，教授，研究方向为营养与食品卫生学。