同位素稀释-超高效液相色谱-串联质谱法检测蜂蜜中泛酸含量

何敏恒，李秀英，曾令浩，黄景晟，郭新东*

（广州质量监督检测研究院国家加工食品质量监督检验中心（广州），广东广州511447）

同位素稀释-超高效液相色谱-串联质谱法检测蜂蜜中泛酸含量

何敏恒，李秀英，曾令浩，黄景晟，郭新东*

（广州质量监督检测研究院国家加工食品质量监督检验中心（广州），广东广州511447）

建立了同位素稀释-超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）检测蜂蜜中泛酸（维生素B5）的快速定量和确证方法。样品经0.1%氨水（V/V）提取，MAX固相萃取柱净化后，以0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水为流动相梯度洗脱，使用HSS T3色谱柱进行分离，电喷雾正离子多反应监测（MRM）模式检测，同位素内标法定量。在优化条件下，泛酸在0.500～500 μg/L范围内线性良好，相关系数（R2）为0.999 6；方法检出限为1.0 μg/kg（S/N=3），定量限为3.0 μg/kg（S/N=10）；回收率在98.3%～98.7%之间，相对标准偏差（RSD）为2.4%～3.1%。通过市售蜂蜜样品测试表明，该方法操作简单、检测结果准确，可用于蜂蜜中泛酸的快速检测。

蜂蜜；泛酸；超高效液相色谱-串联质谱法；同位素稀释

蜂蜜是主要的蜂产品，是人类最早的食物来源之一，目前几乎每个国家都有生产。它的主要成分为果糖和葡萄糖[1]，此外还含有种类丰富的微量元素及多酚，黄酮，有机酸，美拉德反应产物，呋喃醛和呋喃酸，氨基酸和蛋白质，矿物质和水溶性维生素。蜂蜜中微量元素的定性和定量的特征与其物理、化学及生物特性一样，能够成为追溯其植物来源和地理来源的一个有力的工具。因此，近年来对这些微量元素的检测分析方法研究的发展吸引了越来越多的关注。

泛酸也称维生素B5，是B族维生素的一种，是蜂蜜中一种常见的微量元素。泛酸是构成辅酶A的重要成分，在维持细胞的代谢，维护头发、血液、皮肤等的健康方面起着重要作用，泛酸缺乏可导致机体代谢混乱[2]。

目前泛酸的检测方法有紫外分光光度法[3]，高效液相色谱法[4-7]，气质联用法[8]，微生物法[9-11]，液质联用法[12-13]，生物传感器法[14-15]，检测对象多为乳粉和保健食品，由于紫外分光光度法、高效液相色谱法无法满足确证要求；气质联用法需要衍生，操作较繁琐；微生物法步骤较多，分析时间较长；生物传感器法还处于研究阶段，未能成为日常检验的方法；超高效液相色谱-串联质谱法（ultra performance liquidchromatographytandemmassspectrometry，UPLC-MS/ MS）采用保留时间与特征离子对比例对已知目标物进行分析，检测结果的定性定量优势明显。本研究通过在样品中添加同位素内标，建立了一种简单、快速、准确的蜂蜜中泛酸含量分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

泛酸钙（纯度≥98.0%）：德国Dr Ehrenstorfer GmbH公司；泛酸钙-[13C6，15N2]（泛酸钙同位素内标，纯度≥99.5%）：美国IsoSciences公司；氨水（分析纯）：广州化学试剂厂；甲酸（色谱纯）：上海安谱科学仪器有限公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）：美国Merck公司；实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

Agilent 6490超高效液相色谱-串联质谱联用仪：美国Agilent公司；Acquity＠HSS T3色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、Waters Oasis MAX固相萃取柱（60 mg，3 mL）：美国Waters公司；BSA224S电子天平：德国Sartorius公司；MS3 basic涡旋振荡仪：德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

标准储备液：用超纯水分别将泛酸钙，泛酸钙-[13C6，15N2]标准品配制成100 μg/mL（以泛酸计）储备液，4℃保存。

标准工作液：用超纯水分别将泛酸钙标准储备液，泛酸钙-[13C6，15N2]标准储备液稀释至5.0 μg/mL，4℃保存。

标准曲线的制备：用超纯水将标准工作液分别配制成泛酸质量浓度为0.500μg/L、5.00μg/L、10.0μg/L、40.0μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L，同位素内标（泛酸钙-[13C6，15N2]）质量浓度为100 μg/L的系列标准工作液。

1.3.2 样品处理方法

样品提取：称取2.5 g蜂蜜（准确至0.01 g）试样于10 mL比色管中，加入同位素内标工作液100 μL，加入5 mL 0.1%氨水溶液（V/V），涡旋充分溶解，用0.1%氨水溶液（V/V）定容至10 mL，涡旋提取2 min，待净化。

样品净化：取2 mL待净化液至Waters Oasis MAX小柱中（预先用5 mL甲醇，5 mL 0.1%氨水溶液（V/V）活化），依次用6 mL水、6 mL甲醇淋洗，弃去流出液，最后用3 mL 2%甲酸甲醇（V/V）洗脱，收集洗脱液，50℃水浴中氮吹浓缩至近干，用超纯水定容至1 mL，涡旋振荡溶解，经0.22 μm滤膜过滤后供UPLC-MS/MS测定。

1.3.3 仪器条件

色谱条件：色谱柱Waters HSS T3柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流速0.45 mL/min；柱温30℃；进样量2 μL；流动相A 0.1%甲酸溶液（V/V）；流动相B：0.1%甲酸乙腈（V/V）；梯度洗脱：0～2.2 min，92%～80%A；2.2～2.4 min，80%～50%A；2.4～4.0 min，50%A；4.0～4.1 min，50%～92%A；4.1～7.0 min，92%A。

质谱条件：电喷雾离子源；正离子模式；多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式；毛细管电压1.5 kV；离子源气温150℃；鞘气流量（氮气）11 L/min；鞘气温度250℃；毛细管电压3 000 V。泛酸及泛酸同位素内标的定量和定性离子对、碰撞池加速电压、碰撞能量等参数见表1。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的优化

2.1.1 固相萃取柱的选择

蜂蜜成分复杂，其中糖类物质占60%以上，此外还有花粉、色素、蜡质等杂质。在质谱分析中，为了减少基质效应，样品前处理时需要尽量去除这些杂质，否则不仅会影响泛酸分析的准确性，还会影响质谱仪的寿命。固相萃取是一种有效从复杂基质中提取目标分析物，减少基质效应的净化手段。本实验比较了Waters Oasis C18（60 mg，3 mL）、WatersOasisHLB（60mg，3mL）、WatersOasisMAX（60mg，3 mL）三种固相萃取柱对蜂蜜中泛酸的净化效果，结果见表2。

通过对上样流出液、淋洗液和洗脱液的分析，Waters Oasis HLB对泛酸的保留性不强，在上样的过程中就有部分的泛酸流出；Waters Oasis C18对泛酸的保留性较强，但在淋洗过程中仍有少量泛酸被洗脱；Waters Oasis MAX的效果最好，Waters Oasis MAX是阴离子型固相萃取柱，由于泛酸的酸度系数（pKa）值为4.41[16]，而糖类物质的pKa值在12～14之间，通过调节上样液的pH值，可使泛酸选择性吸附在固相萃取柱上，并将糖类物质通过淋洗去除。经净化后，在色谱图上未发现明显的杂峰，由表2可知，泛酸的回收率为95.3%～101.0%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为3.3%～7.1%，因此选择Waters Oasis MAX进行净化。

2.1.2 提取液的选择

蜂蜜中含有有机酸，因此蜂蜜的水溶液呈酸性，泛酸的pKa值为4.41，使用Waters Oasis MAX固相萃取柱要求上样溶液的pH值比泛酸的pKa值大2个单位，因此需要调节蜂蜜溶液的pH值，使其大于6.41。考察了蜂蜜在纯水、0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%氨水溶液（V/V）作为提取液时的回收率，结果见表3。由表3可知，用纯水提取时，回收率为62.3%，而提取液中氨水体积分数≥0.1%时，溶液的pH值均＞9.5，回收率均≥97.5%，因此选择0.1%氨水作为提取液。

2.1.3 固相萃取上样体积的优化

固相萃取柱随着上样体积的增加，会出现过载的现象，从而影响回收率。分别取的待净化液0.5mL、1.0mL、2.0mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL进行测试，考察蜂蜜在Waters Oasis MAX（60 mg，3 mL）柱上的最优上样体积，结果见图1。

由图1可知，固相萃取柱在上样体积＞2.0 mL时过载，而上样体积越大，方法的检出限越低，因此上样体积选择2.0 mL。

2.2 仪器条件的优化

泛酸的极性较强，难以在常规的C18色谱柱上保留。本实验选用了对极性化合物有较强保留的Waters HSS T3色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）进行检测，结果见图2。由图2可知，泛酸在Waters HSS T3色谱柱上有较好的保留，且峰型对称，峰宽为0.3 min。在正离子模式下，在流动相中加入0.1%甲酸有利于泛酸形成[M+H]+分子离子峰，还可以维持流动相在梯度变化时流动相体系的pH平衡。

2.3 方法的验证

2.3.1 线性关系和方法检出限

在优化条件下，对泛酸的系列标准工作液（含有100 μg/L同位素内标）进行检测，记录定量离子峰面积（A）和内标的色谱峰面积（Ai），以A和Ai的比值（y）对泛酸质量浓度（x，μg/L）制作标准曲线，结果见图3。

对泛酸标准曲线进行回归分析，由图3可知，泛酸在0.500～500 μg/L范围内具有良好的线性关系，线性回归方程为y=0.031 9x-0.055 9，相关系数R2为0.999 6。根据仪器的检出限及定量限，计算得到方法检出限（定量离子S/N=3）和方法定量限（定量离子S/N=10）分别为1.0 μg/kg和3.0 μg/kg。

2.3.2 方法回收率和精密度

取蜂蜜样品，分别添加40.0μg/kg、80.0μg/kg、160.0μg/kg 3个水平的泛酸，按1.3的方法进行检测，每个添加水平平行测定6次。泛酸的回收率和精密度见表4。由表4可知，3个添加水平的平均加标回收率为98.3%～98.7%，相对标准偏差为2.4%～3.1%。结果表明，在3个加标水平下，泛酸检测准确度、精密度良好，可以满足蜂蜜中泛酸检测的要求。

2.3.3 实际样品检测

使用本方法检测了10个市售蜂蜜样品的泛酸含量，结果表明10个样品均检出泛酸，含量为84.1～361.0 μg/kg。目前现行的国标GB/T 22246—2008《保健食品中泛酸钙的测定》检出限为2 000 μg/kg，GB/T 5009.210—2008《食品中泛酸的测定》检出限为2 500 μg/kg，灵敏度均无法满足蜂蜜中泛酸检测的要求，本方法的检出限和定量限分别为1.0μg/kg和3.0μg/kg，可满足蜂蜜中泛酸含量检测的要求。

3 结论

本研究建立了使用同位素稀释-超高效液相色谱-串联质谱测定蜂蜜中泛酸的快速检测及确证方法。本方法利用0.1%氨水进行提取，Waters Oasis MAX固相萃取柱净化，Waters HSS T3色谱柱分离，多反应检测（MRM）模式检测，内标法定量。对比现行国标泛酸检测方法，本方法灵敏度高，定性定量准确，操作简单，可以用于蜂蜜中泛酸含量的检测。

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HE Minheng,LI Xiuying,ZENG Linghao,HUANG Jingsheng,GUO Xindong*
(Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute,National Centre for Quality Supervision and Testing of Processed Food(Guangzhou),Guangzhou 511447,China)

A method for rapid quantification of pantothenic acid(PA)in honey by isotope dilution-ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)was developed.The sample was extracted by 0.1%ammonia water(V/V),cleaned-up on Oasis MAX solid-phase extraction column,and finally separated by UPLC using a HSS T3 column,employing acetonitrile with 0.1%formic acid-0.1%formic as the mobile phase for gradient elution.The results were determined by tandem mass spectrometry with multiple reactions monitoring mode and quantified by internal standard method.The result indicated that the linear range was 0.500-500 μg/L,with the correlation coefficients of 0.999 6,the limits of detection(LOD,S/N=3)was 1.0 μg/kg,limits of quantification(LOQ,S/N=10)was 3.0 μg/kg,and the recovery rate ranged from 98.3%to 98.7%with RSD of 2.4%-3.1%(n=6).The sample testing results showed that the method was simple and accurate,and suitable for the determination of PA in honey.

honey;pantothenic acid;UPLC-MS/MS;isotope dilution

O657.6

A

0254-5071（2015）04-0157-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.036

2015-03-20

国家质量监督检验检疫总局科技计划项目（2014QK052）

何敏恒（1984-），男，工程师，硕士，研究方向为食品及食品相关产品分析技术。

*通讯作者：郭新东（1976-），男，教授级高级工程师，博士，研究方向为色谱质谱分析技术研究。