复合酵母菌固态发酵动力学模型的建立

王勇，张锦玲，张立明，郭鹏，袁丽佳，刘大程*

（1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特010018；2.农业部动物临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特010018）

复合酵母菌固态发酵动力学模型的建立

王勇1，2，张锦玲1，2，张立明1，2，郭鹏1，2，袁丽佳1，刘大程1，2*

（1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特010018；2.农业部动物临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特010018）

对复合酵母菌固态发酵动力学模型进行研究，并通过干重法确定发酵过程菌体生物量。采用Logistic方程，Luedeking-Piret方程和Luedeking-Piret/like方程进行最优参数估计和非线性拟合，得到了描述发酵过程中菌体生长、β-葡聚糖和甘露聚糖合成、底物总糖消耗的动力学模型，通过对Luedeking-Piret模型的计算，可知β-葡聚糖和甘露聚糖合成与菌体合成是偶联的。对试验数据与模型预测值进行比较，发现平均相对误差都小于10%，说明模型反映了复合酵母菌发酵过程的动力学特征，表明该动力学模型对指导生产具有实际意义。

复合酵母菌；固态发酵；β-葡聚糖；甘露聚糖；动力学模型

复合酵母培养物是一种含有少量活菌细胞、大量细胞代谢产物和发酵培养基组成的混合物，其核心价值在于它含有的发酵代谢物，主要分为营养代谢物（包括多糖、多肽、有机酸、氨基酸、酶类等）、增味剂和芳香物质、酶类及其他对促进畜禽生长有益的未知因子等。这些营养活性物质在调控瘤胃功能和提高反刍动物免疫功能方面发挥出积极的功效[1-2]。但在前期科研工作中也发现复合酵母菌培养物在固态发酵过程存在着缺陷：培养物中活性物质的产生规律及含量不清楚；发酵工艺多依靠技术工人的经验来控制，缺乏科学数据的支持；发酵结束后复合菌培养物质量的均一性较差，产品质量不稳定。

近几年，国内学者对发酵动力学模型的研究较多。王二强等[3]对以甜高粱秆为基本原料固态发酵生产乙醇的过程建立动力学模型，对指导乙醇固态发酵的放大和生产具有实际意义。魏培莲等[4]对土曲霉固态发酵产洛伐他汀（lovastatin）的过程进行了研究，建立了土曲霉固态发酵的动力学模型。固态发酵动力学研究主要集中在生产酒精及产纤维素酶两个方面，以β-葡聚糖、甘露聚糖为产物建立动力学模型研究鲜见报道。菌体生长动力学模型建立时，多以测定菌体细胞组分含量为主（如葡萄糖胺[5]、核酸[5]和麦角固醇[5]），但这些方法通常较复杂，且发酵基质成分对结果也可能会产生干扰[6]。TEREBIZNIK M R等[8-10]通过测定发酵过程中发酵料干质量的变化建立了估算发酵不同阶段菌体生物量的数学模型。

本研究建立的动力学模型以生产实际为基础，通过测定发酵基质干质量的变化估算菌体生物量，建立菌体生成动力学模型，以β-葡聚糖、甘露聚糖为活性产物建立产物生成动力学模型，应用这些模型对发酵工艺进行优化，对发酵过程进行预测及控制，为生产优质绿色饲料添加剂提供有力的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）BC株、XR4株，均来源于内蒙古农业大学兽医学院反刍动物微生态制剂项目组菌种库。

酵母菌活化培养基采用麦芽汁培养基：麦芽膏粉130 g，氯霉素0.1 g。

固态发酵培养基[11]：麸皮52.69%、玉米片20.45%、玉米粉16.07%、米糠4.09%、棉粕1.86%、豆粕3.99%和无机盐0.85%。

β-葡聚糖、甘露聚糖、铅化玻璃珠（粒径0.45～0.60mm）：美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

LC1100高效液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；T6系列紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；Thermo Scientific MSC1.8生物安全柜：德国Thermo Fisher公司；HPS-160恒温生化培养箱：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；2-16pk高速低温冷冻离心机：美国Sigma-Aldrich公司；BSA22025精密电子分析天平：德国Sartorius公司。

1.3 试验方法

1.3.1 试验菌种制备

取4℃保存的BC、XR4斜面菌种3环，接种于含有300mL无菌麦芽汁培养基的1.5 L三角瓶中，于30℃、180 r/min摇床培养24 h后接种于50 L液体发酵罐中，30℃、180 r/min培养48 h。

固态发酵：发酵料水比为1.00∶0.52（g∶mL），充分搅拌后，将混合好的发酵料堆放于发酵池（2 m×1.5 m×1.5 m）内，料高55 cm。

1.3.2 采样

用采样器每隔3 h从固态发酵料表层下15～20 cm处均匀取样100 g，纬线圈法[12]取样225 g，混合均匀后，平均分为9份，3份样品用于测定干质量，3份样品用于测定葡聚糖和甘露聚糖，剩下3份在80℃条件下烘干至质量恒定，用于测定底物总糖。

1.3.3 底物干质量测定

称取不同时间的样品16g，80℃烘干至质量恒定，称质量[9]。

1.3.4 葡聚糖和甘露聚糖含量的测定

酵母破壁：涡流微珠破壁法[13]。

收集多糖：处理后的样品用冷却的去离子水充分清洗，收集玻璃珠，并收集洗液，重复5次。沉淀物加入3 mL去离子水，充分振荡，收集洗液，重复5次，合并洗液。将所得液体55℃静置24 h蒸发水分[14]。

酸水解：多糖溶液加1.5 mL，72%的硫酸溶液，混匀，室温条件下静置3 h；然后加入7.7 mL去离子水使硫酸的最终浓度为2 mol/L，置于100℃水解4 h，取出冷却至室温后调pH为6.5～7.0，再用去离子水定容至25 mL[15]。

单糖含量测定色谱条件：采用高效液相色谱-示差折光检测器测定样品及校正多糖中甘露糖和无水葡萄糖含量[16]。用Ca型阳离子交换柱进行分离；以相对保留时间定性，色谱峰面积定量。流动相：100%水；柱温：90 ℃；流速：0.5 mL/min。

样品测定：以校正多糖的含量为横坐标，峰面积为纵坐标制备校正曲线，得出回归方程。样品的峰面积代入回归方程中计算得到酵母β-葡聚糖及甘露聚糖含量。

1.3.5 底物总糖测定

采用苯酚-硫酸法[17]。

2 结果与分析

2.1 菌体生长动力学模型的建立

2.1.1 底物干重变化与菌体生物量关系的确定

在固态发酵过程中，将底物烘干后，底物组成为[10]：

根据BORZANI W等[10]研究可得：

式中：W为发酵料干质量，g；S为固态基质干质量，g；B为菌体生物量，g/g；P为产物质量，g/g；dW/dt为发酵料干质量变化率，g/h；dS/dt为固态基质消耗速率，g/h；dB/dt为菌体生长速率，g/h；dP/dt为产物生成速率，g/h。

在固态发酵过程中，底物的消耗主要由于菌体生长，维持菌体生长和生成产物造成[17]，因此，可将式（2）变换为：

其中，

式中：（dS/dt）g为菌体生长消耗固态基质速率，g/h；（dS/dt）m为菌体维持消耗固态基质速率，g/h；（dS/dt）p为产物生成消耗固态基质速率，g/h；Yg为菌体生物量相关系数；YP为产物生成相关系数；-km为维持菌体相关系数。

通过式（1）～（6）可得出底物干质量与菌体生物量的关系：

式中：γ，δ，k1和k2均为方程常数。

由BORZANI W等[10]的研究可知，固态发酵过程中底物干质量变化主要可分为2个阶段，结合图1中底物干质量变化可知，0～21 h为第1阶段，21～30 h为第2阶段，方程分别为：

式中：W1为第1阶段发酵料干质量，g；W2为第2阶段发酵料干质量，g；W0为发酵料起始干质量，g；B0为初始菌体生物量，g/g；μ为菌体生长比生长率，1/h，t为发酵时间，h；ta为第1阶段结束时间，h；tb为第2阶段结束时间，h；kt为方程常数。

由式（7）～（11）可得底物干质量的变化与菌体生物量的方程：

式中：Bs为不同时间菌体生物量，g/g。

将底物干质量结果带入式（10）和式（11）中，利用Origin 8软件进行曲线拟合，不同阶段拟合曲线见图1和图2，拟合方程式：

对式（13）和（14）进行微分，得：

方程（13）和（14）的相关系数R2分别为0.9781和0.9673，方程均极显著（P＜0.000 1），表明方程计算所得干质量值可以分别解释第1阶段97.81%的干质量变化和第2阶段96.73%的干质量变化，说明曲线拟合度较好。

由式（10）、（12）、（13）和（15）可得第1阶段菌体生物量的表达式：

由式（11）、（12）、（14）和（16）可得第2阶段菌体生物量的表达式：

式中：B21表示第21小时菌体生物量，g/g。

2.1.2 Logistic模型的建立

Logistic模型是一个典型的S型曲线，通常被看作是一个表现细胞生长与营养物质之间的非线性关系的经验方程，能很好地反映该过程中菌体浓度增加对自身生长的抑制作用[18]，因此，采用此模型描述复合酵母生长动力学特性，Logistic方程[19]：

式中：Bm为最大菌体生物量，g/g；μm为菌体生长最大比生长率，1/h。

通过方程（17）和（18）计算所得生物量数据利用Origin8软件进行拟合，拟合曲线见图2，参数估计值见表1。

则复合酵母菌固态发酵菌体生长动力学模型为：

方程（21）的相关系数R2为0.961 3，方程极显著（P＜0.001），表明方程曲线拟合度较好，可以描述复合酵母菌在发酵过程中的生长情况。

2.2 产物生成动力学模型的建立

本研究用Luedeking-Piret方程来描述β-葡聚糖，甘露聚糖和菌体生长的关系[18]，即：

式中：α、β为动力学参数，当α=0，β≠0时，产物生成与菌体生长为非偶联型；α≠0，β≠0时，产物生成与菌体生长为部分偶联型；α≠0，β=0时，产物生成与菌体生长为偶联型。

本研究中，β-葡聚糖和甘露聚糖为酵母细胞壁的主要成分，其中β-葡聚糖为酵母细胞壁的主要多糖[19-21]，由于以β-葡聚糖和甘露聚糖建立Luedeking-Piret方程研究较少，因此，对模型的建立进行分类讨论。

（1）假设β-葡聚糖和甘露聚糖的生成模型为偶联型，即当β=0时，式（22）可简化为：

当t=0时，P=P0，将方程（19）带入方程（23）中，可得：

对式（24）积分得：

式中：P0为起始产物质量，g/g；P为不同时间点葡聚糖和甘露聚糖含量，g/g。

将不同时间点葡聚糖和甘露聚糖含量的P，以及B、P0、B0带入式（25）中，利用Matlab 7.0软件，依最小二乘法求回归系数，可得：α1=6.08，α2=1.96（α1为β-葡聚糖生成动力学参数，α2为甘露聚糖生成动力学参数）。

（2）假设β-葡聚糖和甘露聚糖的生成模型为部分偶联型，即β≠0，

当t=0时，P=P0，将方程（19）带入方程（22）中，可得：

对式（26）积分可得：

将不同时间点葡聚糖和甘露聚糖含量的P，以及B、P0、B0带入式（27）中，利用Matlab 7.0软件，依最小二乘法求回归系数，可得：α1=8.3584，β1=-1.03×10-4，α2=1.96，β2=-3.26×10-5（β1为β-葡聚糖生成动力学参数，β2为甘露聚糖生成动力学参数）。

由于β1和β2的值近似为0，因此，可知两种产物的生成与菌体的生长为偶联型，则可得：

β-葡聚糖生成模型：

甘露聚糖生成模型：

方程（28）和（29）相关系数R2分别为0.935 2和0.928 8，方程均极显著（P＜0.000 1），表明所选方程可以较好的反映产物生成的实际情况，相关性结果见图3。

酵母发酵过程中，总糖的消耗与产物合成仅有间接关系，假设基质的消耗用于产物合成的比例很小，可忽略不计，认为总糖的消耗仅用于菌体的生长，所以式（30）可简化为：

2.3 底物消耗动力学模型的建立

常用的底物消耗动力学模型是基于底物消耗物料恒算建立的Luedeking-Piret/like方程式[22]，即：将式（19）带入式（31）积分得：

式中：St为底物总糖含量，g/g；St0为起始底物总糖含量，g/g；YB/t为总糖用于菌体生长的得率常数；Yp/t为总糖用于产物累计得率常数；K为维持常数。

将不同时间点的B，St和B0带入式（32）中，利用Matlab 7.0软件，依最小二乘法求回归系数，可得：

St0=0.121g，YB/t=0.099。

则可得底物消耗动力学模型为：

方程（33）相关系数R2为0.990 7，方程均极显著（P＜0.000 1），表明的所选方程可以很好的反映底物消耗的实际情况，相关性分析结果见图4。

2.4 模型准确性分析

为了验证模型的准确性，在相同条件下进行复合酵母菌固态发酵的重复试验3次，与动力学模型计算值进行比较，结果见表2。由表2可知，菌体生物量、甘露聚糖含量、β-葡聚糖含量和底物总糖含量的相对误差都小于10%，说明建立的动力学模型能较好的描述生产实际中复合酵母菌固态发酵过程。

3 结论

以固态发酵料干质量变化为基础，建立了复合酵母菌菌体生物量生长Logistic动力学模型相关系数R2为0.961 3，方程极显著（P＜0.001），通过模型验证，模型平均相对误差为4.83%，表明在生产实际中复合酵母菌的生长符合Logistic方程。

通过对Luedeking-Piret方程参数α和β分类讨论并计算，发现β-葡聚糖与甘露聚糖的生成与酵母菌为偶联型，其中β-葡聚糖生成模型P=0.070 14+6.08（B-0.004 46），甘露聚糖生成模型P=0.035 4+1.96（B-0.004 46），相关系数R2分别为0.935 2，0.928 8，平均相对误差分别为4.19%和4.08%，方程均极显著（P＜0.000 1）。底物消耗动力学模型St=0.121+10.11（B-0.004 46），相关系数R2为0.990 7，平均相对误差为6.1%，方程极显著（P＜0.000 1），说明模型可较好描述发酵过程，对优化实际生产工艺，控制和预测发酵过程具有重要的参考价值。

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WANG Yong1,2,ZHANG Jinling1,2,ZHANG Liming1,2,GUO Peng1,2,YUAN Lijia1,LIU Dacheng1,2*

(1.College of Veterinary Medicine,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China;2.Ministry of Agriculture Key Laboratory of Animal Clinical Diagnosis Technology,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China)

The kinetics model of solid state fermentation by compound yeast was studied and the biomass was determined based on dry weight variation.The optimal parameters were estimated and nonlinear fitting was performed by logistic model,Luedeking-Piret equation and Luedeking-Piret/like equation.The kinetics model of biomass growth,β-glucan production,mannan synthesis and total sugar consumption were established, respectively.Through the calculation on Luedeking-Piret model,the results showed that the synthesis of β-glucan and mannan was link-coupled with cell.The experimental data were compared with the predicted ones,it showed the average relative error was generally less than 10%,which indicated that the kinetic models can reflect the dynamic characteristics of composite yeast fermentation process.The results showed that the models can guide the practical production significantly.

compound yeast;solid-state fermentation;β-glucan;mannan;kinetic model

S816

A

0254-5071（2015）04-0066-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.015

2015-03-06

国家自然科学基金项目（31260560）；内蒙古科技厅专利转化项目（20140185）；内蒙古农业大学科技成果转化项目（CGZH2013007）

王勇（1988-），男，硕士研究生，研究方向为反刍动物微生态制剂。

*通讯作者：刘大程（1968-），男，教授，博士，研究方向为反刍动物微生态制剂。