细菌与生物材料黏附特性的相关研究

张瑞斐，黄迅悟

解放军第三〇九医院全军骨科中心 关节外科，北京 100091

细菌与生物材料黏附特性的相关研究

张瑞斐，黄迅悟

解放军第三〇九医院全军骨科中心 关节外科，北京 100091

细菌黏附是一个复杂过程，受多种因素影响。随着医学生物材料应用增多，感染发病率也明显增高，如何防治生物材料相关感染是临床急需解决的问题。因此，研究细菌与生物材料黏附对于探讨生物材料植入机体引起的感染具有重要意义。本综述简单介绍了生物材料中有关细菌黏附机制，着重分析了细菌黏附影响因素，以及细菌自身特性、宿主因素对细菌黏附的影响，并在总结细菌黏附研究中所存在问题的基础上，对未来研究的发展趋势提出展望。

生物材料；细菌黏附；生物膜

细菌黏附及其意义的研究可以涵盖人类生活的不同方面。随着生物材料应用增多，相关感染发病率也明显增高，防治生物材料相关感染是临床亟需解决的问题[1]。细菌附着在人体组织和植入的生物材料表面是感染发病机制中一个重要环节[2]。因此, 研究生物材料细菌黏附对于探讨生物材料植入机体引起的感染具有重要意义, 阻断细菌黏附是防治与生物材料相关感染的关键环节[3]。本文主要介绍了生物材料中有关细菌黏附特性的相关研究。

一般来说，两种物质之间表面力相互作用结果称为黏附。在黏附过程中，细菌在植入物表面分泌一层粘液，抵御来自宿主的免疫反应，降低其对抗生素的敏感性[3]。细菌产生的细胞外物质（胞外聚合物主要由多糖组成）可保护细菌减少抗生素的杀灭。细菌如不能产生细胞外物质往往致病力较弱。细菌可以在材料表面停留很长一段时间[4]。一旦宿主的免疫活性降低，即在假体周围的组织中生长。

1 细菌黏附机制

细菌黏附在生物材料表面及临近组织是引起感染的起始动因。细菌在材料表面黏附可分为两个阶段：①初期可逆物理相阶段；②时间依赖性不可逆分子和细胞阶段[4]。从物理化学的角度来看，非特异性相互作用力可以导致细菌黏附，当局部表面的相互距离＜5 nm时，物质间的相互作用力利于细菌黏附。生物材料表面的细菌黏附，特异性和非特异性相互作用可能发挥着重要作用[5]。

（1）第1阶段：细菌和材料表面之间物理化学方面的相互作用。细菌通过物质间的相互吸引力附着在材料表面上，随后吸附在材料表面上[5]。这种相互作用力的影响包括：布朗运动、范德华力、引力、表面静电和疏水作用。可进一步划分为长程和短程相互作用。当两者相距50 nm时的相互作用力称为长程相互作用力，这种作用力是非特异性的。短程相互作用是指相互距离到达5 nm时，离子相相互作用、偶极相互作用以及疏水相互作用[5]。细菌通过长程相互作用到达材料表面后，短程相互作用变得更加重要。

（2）第2阶段：细菌和材料表面，分子和细胞之间的相互作用。在第2阶段的黏附中，主要是细菌和材料表面分子间的特异性反应[6]。细菌通过表面的聚合物结构，选择性黏附到材料表面使黏附更加稳固。第2个阶段中，某些细菌能够形成生物膜。生物膜的形成过程中，细菌分泌的胞外多糖层能保留营养成分和耐受宿主的免疫应答。

2 细菌黏附影响因素

细菌黏附是极其复杂的过程，受多种因素影响，包括环境因素（如血清中存在蛋白质或抗生素）、抗菌性能和材料表面特性[7-8]。细菌在黏附过程中通过改变材料表面特性和相关环境，从而达到稳固的黏附。

2.1 环境因素

环境因素是指一般环境中的某些因素，如温度、曝光时间、细菌浓度、化学处理、抗生素和水流条件等[7-8]。

水流条件能明显减少细菌黏附，对附着细菌的数量、生物膜结构和性能有重要影响[10]。Katsikogianni等[9]对一些能影响细菌黏附的底物研究，发现剪切速率从150/s至1500/s时，附着的细菌数量显著减少。其中，类金刚石薄膜的表现与其他材料不同，主要原因是其具有较高的表面粗糙度值。高粗糙度值能提高细菌的表面接触面积，使细菌优先附着于粗糙表面，保护自己免受剪切力的影响。Katsikogianni等[9]在另一项研究中发现，表皮葡萄球菌的两个菌株，剪切速率从50/s增至500/s或1000/s，特别是当到达2000/s时，黏附反而增加。一般认为，随着剪切速率增加，附着的细菌数量随之减少，然而两者之间存在一种平衡。Mohamed等[11]研究发现，存在较多金黄色葡萄球菌受体的胶原蛋白涂层盖玻片，当剪切速率由50/s增至300/s时，细菌黏附增加。剪切速率在超过500/s时黏附下降。当盖玻片细胞受体较少的情况下，流速对黏附的影响并不明确。

电解质的浓度，如氯化钾、氯化钠和pH值也会影响细菌的附着。pH值的变化可以显著影响细菌的生长和黏附[7-8]。细菌能通过膜结合质子泵挤出质子调节自己的胞质pH值，并形成跨膜电化学梯度。细菌通过自身调节能适应小幅度的pH值变化[12]。有研究表明，培养基中缓慢加入HCl与快速加入HCl相比，能增加细菌的存活率。Hamadi等[12]观察pH值变化对金黄色葡萄球菌ATCC25923黏附性的研究，应用扫描电镜发现，金黄色葡萄球菌ATCC25923的黏附依赖于悬浮介质的pH值。在高度酸性（pH为2～3）或碱性条件下，易于细胞黏附；当pH为5为时黏附减少。Kinnari等[13]对矫形外科内植物感染中最常见的致病菌，金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌进行体外模拟研究发现，当pH值从7.4下降至6.8时，葡萄球菌在HA和BCP两种材料表面附着显著下降。材料表面pH值降低时能减少细菌感染。

2.2 抗菌药物

抗生素对细菌黏附的影响，取决于细菌的易感性和抗生素浓度[8]。Kohnen等[14]研究发现利福平、司帕沙星能减少结核分枝杆菌在材料表面的黏附。Stigter等[15]研发出一种植入钙含磷酸酯的仿生钛合金涂层Ti6Al4V，该涂层能以浓度依赖的方式，有效对抗金黄色葡萄球菌生长。但是，生物膜中的细菌有别于浮动的细菌。胞外聚合物能将营养成分和矿物质引导到生物膜内部，同时免受有害物质的影响。生物膜对抗生素耐药有三个机制：胞外聚合物质能减少抗生素的渗透、造成有利的内部环境（例如厌氧）和对细菌细胞分化提供更好的保护。即使抗生素对寄生菌的治疗有效，仍会有部分细菌存活。Prado等[16]对悬浮肺炎链球菌及其生物膜对抗生素的易感性进行评估发现，抗生素治疗对细菌黏附的抑制效果大于对生物膜形成的抑制效果。因此，最佳的抗感染战略是寻求抑制细菌生物膜的形成。无论是物理的相互作用，还是细菌或材料表面特性的变化，都可能会影响细菌的黏附[7]。

2.3 材料表面特性

材料的表面特性，包括生物材料表面化学成分、表面电荷、疏水性、表面粗糙度和物理结构等[7-8]。

材料表面的化学成分能影响细菌的黏附和繁殖，对细菌黏附的影响主要表现在材料的疏水性和表面电荷。金属材料表面有较高的表面能、负电荷和亲水性，聚合物材料有表面能低、不带电荷和疏水性的特性[7-8]。水接触角（WCA）能反应材料表面的亲疏水性，主要由接触角测量评估材料表面的疏水性。高WCA表现为疏水性和低WCA表现为亲水性。由于细菌及材料表面的亲疏水性不同，细菌黏附的情况也不同[7]，如金黄色葡萄球菌在疏水性区域利用蛋白质共价结合到细胞壁上。Katsikogianni等[9]发现类金刚石碳涂层的PVC与无涂层PVC相比，表皮葡萄球菌黏附水平较低，可能是由于表面改性导致疏水性降低所致。此外，Katsikogianni等[9]还发现氟化PVC与经过灭菌的PVC相比，表皮葡萄球菌黏附增加，可能由于PVC表面氟化后的疏水性增加所致。由于表皮葡萄球菌是一种温和的疏水性的细菌，因此在疏水性高的氟化材料表面细菌黏附增加。

材料表面的粗糙度是通过粗糙度测量系统测得二维参数，是另一个影响细菌黏附的因素。粗糙的材料表面有利于细菌黏附及生物膜的堆积，而光滑表面不利于细菌黏附和生物膜堆积。这是由于粗糙的表面为细菌定植提供了更多机会[7-8]。Oztürk等,应用氮（N）离子表面改性的钴铬钼合金和抛光涂层的钴铬钼合金材料对YT - 169A表皮葡萄球菌菌株生物膜形成进行研究，结果表明表皮葡萄球菌株YT - 169A在氮（N）离子表面改性的钴铬钼合金材料表面黏附多于抛光涂层，这主要归因于材料表面的粗糙度高于抛光界面。Teughels等[17]发现表面增加粗糙度增加能促进植入物表面的生物膜形成。Katainen等[18]指出影响细菌黏附的是纳米级粗糙度。纳米级表面粗糙度对初始附着的细菌有重要影响，可能是由于提供的接触点的数目所致。Webster等[19]研究钛合金表面细菌定植时发现，表面纳米粗糙度增大时细菌定植效率增加。由于临床上不同假体表面粗糙度不同，植入体内后对细菌黏附的影响各不相同。因此，需要更多的研究来测试表面粗糙度值对细菌黏附的影响。

材料表面的物理结构相比表面粗糙度更加复杂。它是一种通过形态学描述的三维材料表面[7-8]，如单纤维界面、编织界面、多孔界面或网格状界面等。Webster等[19]将多孔材料与无孔材料植入感染金黄色葡萄球菌的小鼠皮下，发现多孔材料相比无孔材料感染率显著增加。这表明，细菌优先于多孔表面上黏附和定植。此外，通过扫描电镜发现相比平滑的材料表面，细菌更易黏附在沟槽和网织材料表面，可能是由于局部的表面积增加导致[7-8]。

3 细菌自身特性对黏附影响

细菌的特点：同种材料表面，不同细菌附着所表现的理化特性也不相同。主要因为细菌自身的表面特性不同，包括细菌表面的疏水性和细菌的表面电荷的影响。

细菌表面的疏水性是影响黏附的重要物理因素。一般情况下，疏水性细菌更喜欢附着在疏水性材料表面；而亲水性材料表面疏水性细菌附着相比亲水性细菌少[7-8]。细菌的疏水性主要取决于菌株种类、培养基、生长时间和细菌表面结构。Walker等[20]研究发现在培养中期黏附性与疏水性相比稳定期有所降低。由于大肠杆菌细菌培养时间短，大肠杆菌外膜上亲水性（酸性）的蛋白质不足，从而导致细菌表面的疏水性及黏附性降低。Kuntiya等[21]发现假单胞菌表面的疏水性随着细胞年龄的增加逐渐降低。另外，Kuntiya等[21]发现通过添加0.5％的氯化钠改变培养基的成分，导致细胞表面疏水性降低的更快。可能有三种原因导致疏水性的改变：①虽然机制尚不明确，但氯化钠可以增加胞外多糖的生成。胞外多糖的主要表现为电中性和亲水性，导致细菌疏水性降低；②有学者指出老化细胞的胞外多糖含量增多；③细胞在分批培养中养分缺乏会使胞外多糖生成增加，可能是导致疏水性降低的另一个原因。这些结果表明，培养基中存在氯化钠或细胞的年龄均会影响细胞表面的疏水性。导致生物膜的形成和生长。

细菌的表面电荷可能是影响黏附的另一种重要物理因素。在介质中表面电荷能吸引反电荷的离子形成双电荷层。大多数颗粒由于表面电荷的原因，形成电离基团悬浮在水溶液中。在水悬浮液中的细菌几乎总是带负电荷。细菌表面电荷的变化，主要受细菌种类、生长培养基pH值、悬浮缓冲液的离子强度、细菌年龄和细菌表面结构的影响[7-8]。

4 宿主血清和组织蛋白对黏附影响

当血液与材料接触时首先发生蛋白的吸附。蛋白从水溶液吸附到固体表面通常分为三个步骤。首先，溶液中的运输蛋白接近材料表面；随后，由蛋白附着在材料表面；最后，经蛋白质构象变化吸附在材料表面[7-8]。当内植物植入宿主组织后，蛋白的细胞外基质吸附到材料表面形成蛋白层，有利于自由浮动的细菌黏附。然后附着的细菌迅速繁殖并产生粘性分泌物，最后形成致密的贴壁细胞形成生物膜。

宿主血浆蛋白对细菌黏附的影响，蛋白质可以通过改变细菌表面的理化性质改变细菌的黏附。由于材料表面吸附的蛋白不同，黏附细菌不同[7-8]。因此,血浆蛋白在细菌黏附中的作用逐渐引起重视。这些蛋白有的促进细菌黏附,也有的抑制细菌黏附，如白蛋白、纤维连接蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白、变性的胶原蛋白等。

纤维连接蛋白（Fibronectin，FN）能使细菌相互凝结、聚集, 增加细菌在生物材料表面的附着。多数研究表明，生物材料表面吸附FN能促进细菌的黏附[7-8]。在纤连蛋白分子中，有两个不同的结合位点为细菌的结合点：第一个结合位点位于N末端，第二结合位点位于C-末端附近。一项研究应用等离子体共振发现在表皮葡萄球菌的C-末端片段，FN具有较高的亲和力[7-8]。因此，FN在促进细菌附着到生物材料表面起到了至关重要的作用。

人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HAS）能吸附在如材料聚合物、陶瓷和金属等材料表面，明显的抑制细菌的黏附[7-8]。An等，在37℃ 下将钛合金表面用200 mg/mL的HAS处理2小时后发现相比未处理的钛合金，表皮葡萄球菌黏附减少95％。Kinnari等[22]在钛表面上应用HSA涂层观察金黄色葡萄球菌及绿脓杆菌的黏附情况，发现细菌明显比未涂层的表面黏附减少。同时还指出细菌黏附依赖于整体细菌浓度。金黄色葡萄球菌浓度由82％增至95％时，HSA涂层表面细菌黏附显着抑制；而铜绿假单胞菌浓度由29％增至37％时受到抑制。但是，HSA的抑制作用似乎依赖于细菌菌株和物种。白蛋白对细菌黏附的抑制作用，可能是通过结合细菌从而使其亲水性增加所致。然而，在最近的一项研究中，Prado等[16]研究发现溶液中HSA的浓度从40～25000 mg/mL逐渐增加时，能刺激肺炎链球菌菌株细菌生长。而较高浓度，则抑制细菌生长。

纤维蛋白原（Fibrinogen，FG）是另一种重要的蛋白质，通过细菌细胞膜表面特有的纤维蛋白原受体桥接于生物材料表面[23]。Ardehali等[24]通过观察金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大肠杆菌在纤维蛋白原的PVC材料表面的吸附情况发现，FG-涂层的材料相比无FG涂层细菌吸附力增大5倍以上。Ardehali等[24]也报道了类似结果，在聚氨酯表面喷涂纤维蛋白原后金黄色葡萄球菌的附着力增加。这些研究表明，在纤维蛋白原存在的情况下，能介导细菌特异性的黏附到材料表面，增加细菌的黏附力。

层粘连蛋白对细菌黏附具有促进作用。有研究发现，层粘连蛋白能增加金黄色葡萄球菌和中枢神经细胞的黏附力[25]，但与FN和血纤维蛋白原的影响相比促进作用较弱[7]。也有报道称在金黄色葡萄球菌中存在层粘连蛋白受体。

血清（Serum）在介导细菌黏附方面有一定的抑制作用。有研究表明，在生物材料处于血清中时对细菌黏附有较强的抑制作用。Baral等[25]将聚氨酯浸泡于0.5％或更高浓度的牛/人血清或血浆中观察细菌的黏附情况，发现与对照组相比细菌黏附减少5倍以上。此外，有学者指出血清抑制细菌的附着很大程度上依赖于血清中的转铁蛋白。

5 结论

了解微生物与生物材料之间的相互作用，能帮助我们更好的诊断和治疗内植物感染，找到抑制生物膜形成的方法或策略。应用抗菌药物控制生物膜是一个简单而常用的方法。许多对浮游细菌有效的抗菌药物，对控制相同细菌生物膜的生长无效。这些抗菌药物有不同的化学和行动模式，联合使用多种抗菌药物可以提高抗菌性能以及防止细菌产生耐药性。生物膜对传统抗生素治疗的防御性，促使人们对材料的合成表面及涂层进行了大量的研究，已抵御细菌定殖。

矫形外科手术中使用的生物材料对细菌的感染敏感性不同。感染细菌的黏附和生长依赖于生物材料的表面特性，例如疏水性和表面粗糙度。因此，在开发新型的抗感染生物材料时，为影响细菌与材料表面的相互作用，必须考虑材料的表面形态和疏水性。

因此，细菌黏附是一个非常复杂的过程，受多种因素影响，需要进一步的研究，以了解细菌黏附和植入物感染的机制。提供适当的方法，以防止它们发生。未来的研究必须努力，以更好地了解内植物相关感染的发病机制，尤其是抗生素的耐药性现象应引起重视。未来的研究应侧重在感染动物模型建立和体内生物膜生长方面。

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biomaterials；bacterial adhesion；biomembrane

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10.3969/j.issn.1674-1633.2015.11.024

1674-1633（2015）11-0076-05

2015-08-27

首都临床特色应用研究（Z121107001012094）。

黄迅悟，主任医师。

通讯作者邮箱：hxw_309@163．com