高产Monacolin K红曲霉菌种的筛选及液态发酵条件优化

陈 泉，吴远征，扈进冬，王贻莲，赵晓燕，赵吉兴，李 耀，李纪顺

（1.山东省科学院中日友好生物技术研究中心，山东省应用微生物重点实验室，山东济南250014；2.山东中惠生物科技股份有限公司，山东惠民251706）

高产Monacolin K红曲霉菌种的筛选及液态发酵条件优化

陈 泉1，吴远征1，扈进冬1，王贻莲1，赵晓燕1，赵吉兴2，李 耀2，李纪顺1*

（1.山东省科学院中日友好生物技术研究中心，山东省应用微生物重点实验室，山东济南250014；2.山东中惠生物科技股份有限公司，山东惠民251706）

为了提高红曲霉（Monascus）液态发酵生产Monacolin K的能力，一种新型的常压室温等离子体（ARTP）诱变技术被应用于产Monacolin K红曲霉菌株的诱变选育工作；同时，通过构巢曲霉（Aspergillus nidulans）平板对峙培养的筛选方法，选育获得较初始红曲霉菌Monacolin K产量提高60%以上的突变菌株MP60-6。确定发酵培养基组成为甘油5%，米粉50 g/L，蛋白胨15 g/L，NaNO32 g/L，MgSO41 g/L，ZnSO42 g/L，KH2PO41.5 g/L，并进一步确定在发酵第3、第4天添加0.1%的乙酸和0.2%的柠檬酸，发酵第8天补加10%的甘油。在上述条件下发酵17 d后Monacolin K产量可以达到1 302 mg/L，为出发菌株产量的2.66倍。

Monacolin K；红曲霉；诱变；液态发酵

Monacolin K是最早由日本学者远腾章在红色红曲霉中发现的一种胆固醇合成抑制剂[1]，其商品名为洛伐他汀（Lovastatin），是一种新型的调整血脂药，深受广大患者的欢迎。Monacolin K具有酸型和内酯型两种存在形式，研究发现，真正起降脂作用的是酸型Monacolin K。内酯型的Monacolin K本身无活性，需要人体内羟基水解酶水解后才能发挥降脂功效，从而增加肝肾负担。天然发酵的红曲霉产生的主要是酸型洛伐他汀，并且其发酵产物中除了含有Monacolin K之外，还有一系列Monacolin结构类似物、不饱和脂肪酸等生理活性物质存在，不仅具有协同调节血脂的功效，而且极大地降低了纯品Monacolin K的副作用[2-3]。因此，以红曲霉开发的保健食品、药品在国内、国际市场上都非常受欢迎。

目前红曲霉生产洛伐他汀主要采用固态发酵的方式。固态发酵具有生产过程简单、投资少、产量高、后处理简单等优点，但固态发酵周期较液态发酵长、条件不易控制、容易染菌等。在工业化固态发酵时，培养基和培养条件对其产量和品质的影响很大，获得的产品品质参差不齐，已逐渐失去市场竞争力。液态发酵法具有规模大，自动化程度高，人力成本低，生产过程易控制等显著优点[4-5]。但是，由于受到产量和生产成本的限制，液态发酵生产Monacolin K的研究一直停留在实验室水平，没有形成产业化规模[6]。因此，提高红曲霉液体发酵产生Monacolin K的产量成为目前亟待解决的问题。

优良菌种的选育是提高红曲霉中Monacolin K产量的一个较为切实可行的方法。在红曲霉菌株诱变中常用的方法包括紫外诱变、氯化锂诱变、超高压诱变、亚硝酸和硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）诱变以及多种方法联用的复合诱变[7-10]。随着诱变技术的进步，很多新兴的诱变方法也被逐渐用于红曲霉菌株的选育，比如离子束诱变[11]、激光诱变和空间诱变等[12-13]。

另外，改良红曲霉发酵培养基的成分，尤其是研究发酵工艺中作为添加剂的碳源、氮源、无机盐等因素对红曲霉发酵生产Monacolin K的影响，也是目前研究的重点和热点。目前已报道的可有效促进红曲霉合成洛伐他汀的添加剂包括：碳源有甘油、可溶性淀粉、麦芽糖、蔗糖、乙醇、乙酸；氮源有蛋白胨、玉米浆、大豆粉、NaNO3；无机盐有MgSO4、ZnSO4[14-17]。

筛选适用于液态发酵的红曲霉Monacolin K高产菌株并优化其发酵条件，是解决当前Monacolin K液态发酵产量不高的最直接也是最行之有效的方法，对于国内红曲产业的发展具有一定的推动作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

紫色红曲霉（Monascus purpureus）ZH01：山东中惠食品有限公司。

1.1.2 培养基

种子培养基：米粉30 g，葡萄糖20 g，NaNO32 g，蛋白胨15g，MgSO4·7H2O 1g，KH2PO41.5g，加水至1000mL，pH自然。

发酵培养基：米粉50 g，甘油50 mL，NaNO32 g，蛋白胨15 g，MgSO4·7H2O 1 g，ZnSO42 g，KH2PO41.5 g，加水至1 000 mL，pH自然。

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，加水至1 000 mL，pH自然。

1.1.3 主要试剂

葡萄糖、乳糖、木糖、蔗糖、甘油、蛋白胨、NaNO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、ZnSO4、CaCl2、NH4Cl、（NH4）2SO4、NH4NO3等化学试剂均为国产分析纯，大豆蛋白粉、酵母粉、豆粕粉和牛肉膏等均为生化试剂。

1.2 仪器与设备

常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）诱变育种系统：无锡思源清生物科技有限公司；Agilent 1260 Infinity四元液相色谱仪：安捷伦科技有限公司；HZQ-Q全温振荡器、HPS-250生化培养箱：北京东联哈尔有限公司；KQ-400KDE型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 液体培养方法

从PDA平板上刮取红曲霉菌落接种到种子培养基中，30℃条件下摇床培养3 d，按照15%的接种量转接到发酵培养基，26℃条件下培养14～21 d。

1.3.2 红曲霉诱变方法

（1）单孢子悬液的制备

以生理盐水将孢子从平板或斜面上洗下，制得孢子悬液，接种到小米培养基（8 g小米+10 mL水）中，培养48 h左右，加入生理盐水制得菌悬液以无菌纱布过滤，以玻璃珠振荡打散至单孢子悬液，备用。

（2）ARTP等离子流诱变

以时间为可变参数，功率和气量为固定参数（功率为100 W，气量为10 L/min）。首先，打开紫外灯对操作仓消毒30 min。同时，在超净台中取待诱变孢子悬液10 μL均匀涂于载片上，打开无菌风吹干；将装有样品载片的平板移至ARTP操作仓，用无菌镊子将载片放于对应孔位，调节载台下方旋钮，使载片位于气流出口2 mm处，并关闭仓门；设置处理时间，点击“开始”按钮处理样品；样品处理完毕，用无菌镊子将载片放入装有1 mL生理盐水的离心管中，将离心管振荡1 min洗脱载片上的菌液；对得到的菌悬液适当稀释后涂布PDA平板，28℃培养72 h。

1.3.3 洛伐他汀高产红曲霉菌株的初筛

构巢曲霉对峙培养法：使用平皿打孔器移取相同大小的待筛选红曲霉菌落接种到PDA平板的一侧，28℃培养5 d后，在平板另一侧对应位置接种相同大小的构巢曲霉菌落，将平板放于26℃培养箱中进行静置培养7 d后，测量构巢曲霉的菌落直径。

1.3.4 洛伐他汀的检测方法

发酵液样品处理：取250 μL发酵液与750 μL甲醇一起加到1.5mL的离心管中，超声波振荡处理60min，经0.22μm的薄膜过滤后，样品中的洛伐他汀含量进行高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）测定。

HPLC检测条件：色谱柱250 mm×4.6 mm C18柱；紫外检测器；检测波长238 nm；流动相：甲醇∶水∶磷酸=385∶115∶0.14（V/V）；流速1 mL/min；进样量10 μL。

2 结果与分析

2.1 对峙培养实验中构巢曲霉菌落直径与红曲霉合成洛伐他汀能力的关系

红曲霉产生的洛伐他汀对构巢曲霉的生长具有一定的抑制作用。因此，将红曲霉与构巢曲霉进行对峙培养，从理论上来说，红曲霉合成Monacolin K的能力越强，其对应的构巢曲霉的菌落直径就越小。为了验证这一推论，随机挑取ARTP等离子体诱变得到的诱变株与构巢曲霉进行对峙培养，同时将这些诱变株进行液体摇瓶培养14 d，利用HPLC检测其Monacolin K的产量，从而分析在对峙培养实验中构巢曲霉菌落直径与红曲霉合成Monacolin K能力的关系，结果如图1所示。

由图1可知，随着构巢曲霉菌落直径的增大，其对应红曲霉Monacolin K的产量出现逐渐减少的趋势。因此，构巢曲霉的菌落直径可以作为衡量对峙培养的红曲霉合成Monacolin K能力的一个指标。采用构巢曲霉对峙培养实验对产MonacolinK红曲霉进行初筛具有通量高，准确性相对较高的优点。

2.2 诱变菌株的遗传稳定性

通过构巢曲霉对峙培养初筛以及液体摇瓶培养后HPLC检测复筛，共得到4株（MP60-3、MP60-6、MP45-1、MP45-11）Monacolin K产量较出发菌株有明显提高的诱变株。相对于出发菌株489.34 mg/L的Monacolin K产量，筛选得到的这4株菌Monacolin K的产量提高了1.4～1.7倍不等。为了验证得到的4株菌产生Monacolin K的遗传稳定性，将这4株红曲霉菌株传代5代，分别检测其洛伐他汀产量的变化，结果如表1所示。

由表1可知，MP60-3、MP45-1和MP45-11的Monacolin K产量从第3代开始迅速下降，经五代培养后其产量都有大幅减低，不具有工业化大生产的优越性。菌株MP60-6的Monacolin K产量较稳定，说明其遗传性状稳定，具有应用于工业化大生产的潜力，成为进一步的研究对象。

2.3 最佳碳源的选择

碳源是发酵培养基中最重要的成分之一，对微生物生长代谢的作用主要为提供细胞的碳架，提供细胞生命活动所需的能量，提供合成产物的碳架。红曲霉的液体发酵一般需要速效碳源和迟效碳源两种。培养基中的速效碳源在发酵的前期，对红曲霉的快速生长繁殖有最直接的影响。为确定红曲霉MP60-6生产Monacolin K的最佳速效碳源，比较了其分别利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘油和木糖，初始浓度均为5%发酵Monacolin K的产量，结果见图2。由图2可知，在选定的5种速效碳源中，甘油为速效碳源时发酵液Monacolin K最高可达1 011 mg/L，明显优于其他速效碳源。此外甘油来源丰富、组成简单、价格便宜，故选定甘油为最佳速效碳源，而其迟效碳源通常都是使用大米粉，其有利于红曲霉生长后期次级代谢产物的形成。故采用5%甘油+50 g/L米粉作为红曲霉发酵的初始碳源。

2.4 最佳氮源的选择

氮源是构成菌体细胞中核酸、蛋白质和细胞质的主要成分，也是合成各种含氮代谢产物的重要原料，对微生物的生长和目标产物的积累有重要的影响。培养基中使用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。在培养基中合理地加入不同氮源，有利于缩短红曲霉生长时间，提高Monacolin K的产量。实验比较的有机氮源包括酵母粉、大豆蛋白粉、牛肉膏、蛋白胨和豆粕粉，其初始浓度均为15g/L，无机氮源包括NH4Cl、（NH4）2SO4、NH4NO3和NaNO3，其初始浓度均为2g/L。不同氮源对红曲霉MP60-6产Monacolin K的影响结果见图3。

由图3可知，有机氮源中蛋白胨发酵Monacolin K产量最高，无机氮源中NaNO3发酵Monacolin K产量最高。故发酵培养基中分别选用15 g/L蛋白胨和2 g/L NaNO3分别作为有机和无机氮源。

2.5 无机盐对红曲霉产Monacolin K的影响

培养基中的无机盐在微生物生长和代谢产物合成中也具有举足轻重的作用。本实验比较了不同质量浓度（1 g/L、2 g/L、4 g/L）的MgSO4、ZnSO4和CaCl2对红曲霉MP60-6产Monacolin K的影响，结果见图4。

由图4可知，MgSO4、ZnSO4在一定质量浓度范围内对于红曲霉MP60-6产生Monacolin K都具有一定的促进作用，其中以MgSO4的促进作用更为明显，而CaCl2的作用则微乎其微。结果表明，MgSO4质量浓度在1 g/L时对Monacolin K的产量提高效果最显著，MgSO4质量浓度＞1 g/L时Monacolin K的产量反而有所下降；同样，ZnSO4质量浓度在达到2 g/L时Monacolin K的产量达到最高。因此，选择在发酵培养基中添加1 g/L MgSO4和2 g/L ZnSO4。

2.6 添加乙酸和柠檬酸对红曲霉产生Monacolin K的影响

大量文献报道，在红曲霉发酵过程中添加乙酸或柠檬酸有利于提高Monacolin K的产量[2，17-18]。在发酵开始的第3、第4天每天分两次分别添加0.1%、0.2%和0.3%的乙酸或柠檬酸，然后比较其Monacolin K的产量，结果见图5。

由图5可知，添加乙酸和柠檬酸都能够从不同程度上促进Monacolin K的产生，并且乙酸对红曲霉MP60-6的促进作用比柠檬酸更显著。每次添加0.1%的乙酸和0.2%的柠檬酸能够达到提高Monacolin K的最佳效果。这种促进作用的原因可能是：乙酸和柠檬酸都是红曲霉代谢中产生乙酰辅酶A（coenzyme A，CoA）的直接前体物质，而根据已知的Monacolin K的合成途径，胞内的乙酰CoA含量是决定Monacolin K产量的关键因素。因此，在发酵过程的第3、第4天每天两次添加0.1%乙酸和0.2%柠檬酸有利于胞内乙酰CoA的积累，从而提高Monacolin K的产量。

2.7 甘油补加的时机对红曲霉产生洛伐他汀的影响

按照1.3.1所述的培养条件，在初始碳源为50 g/L的米粉培养基中，在培养的第2、5、8、10天向不同的摇瓶中补加10%的甘油，并定时取样，检测其Monacolin K合成的情况，结果见图6。

由图6可知，第8天和第10天开始补加甘油的摇瓶中红曲霉产生Monacolin K的产量明显高于其他摇瓶的产量，并且以第8天补加的效果最佳。同时，第2天和第5天补加甘油Monacolin K的产量比不补加甘油的对照产量还要低。这说明作为次级代谢产物的Monacolin K是在菌体生长后期开始大量积累，前期生长过快反而不利于其产生；从Monacolin K的合成曲线上看，发酵中Monacolin K的大量积累集中在第12～17天，这一阶段的积累速度呈指数增长。而从补加碳源上来看，在第8天补加甘油后，到了第12天Monacolin K才开始大量积累，这说明Monacolin K的积累需要一定的“准备期”。因此，在发酵的第8天补加10%的甘油对于提高Monacolin K产量效果最佳。

3 结论

利用ARTP等离子流诱变技术对红曲霉ZH01进行诱变处理，并建立构巢曲霉对峙培养快速筛选方法，获得4株Monacolin K产量显著提高的红曲霉菌株。经遗传稳定性实验分析后，最终选择MP60-6作为生产菌株，该菌Monacolin K产量较出发菌株提高了60%以上。

该文考察了红曲霉MP60-6发酵中碳源、氮源、无机盐以及添加乙酸、柠檬酸和甘油等对其Monacolin K产量的影响，确定甘油为最佳速效碳源；蛋白胨和NaNO3分别为最佳有机和无机氮源；MgSO4和ZnSO4有利于促进Monacolin K的产生，而CaCl2的影响不明显；添加乙酸和柠檬酸都能提高Monacolin K产量，最佳浓度添加量分别为0.1%和0.2%；Monacolin K在发酵后期开始大量积累，在发酵的第8天补加甘油能显著提高Monacolin K的产量。经过初步优化培养基成分及发酵条件，红曲霉MP60-6液态发酵Monacolin K的最终产量可达到1 302 mg/L，为出发菌株ZH01产量（489.3 mg/L）的2.66倍。

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Screening ofMonascuswith high Monacolin K yield and optimization of its liquid-state fermentation condition

CHEN Quan1,WU Yuanzheng1,HU Jindong1,WANG Yilian1,ZHAO Xiaoyan1,ZHAO Jixing2,LI Yao2,LI Jishun1*
(1.Shandong Provincial Key Laboratory for Applied Microorganism,Biotechnology Center of Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014,China;2.Shandong Zhonghui Biotechnology Co.,Ltd.,Huimin 251706,China)

In order to improve the production of Monacolin K byMonascus,a novel method based on the Atmospheric and Room Temperature Plasma(ARTP)was applied to screen theMonascusstrain with higher Monacolin K yield.A mutant strain MP60-6 was obtained through the screening method of plate confrontation culture ofAspergillus nidulans,and the yield of Monacolin K by MP60-6 was 60%higher than that of the initial strain. The optimal medium compositions were obtained as follows:glycerol 5%,rice powder 50 g/L,peptone 15 g/L,NaNO32 g/L,MgSO4·7H2O 1 g/L, ZnSO42 g/L,KH2PO41.5 g/L.And 0.1%acetate and 0.2%citrate were added at the 3thand 4thdays,10%glycerol was added at the 8thday in the liquid-state fermentation of MP60-6.After cultivation for 17 d under the optimized condition,the Monacolin K yield was 1 302 mg/L,which was 2.66 times of the original strain.

Monacolin K;Monascus;mutation;liquid-state fermentation

Q939.9

A

0254-5071（2015）06-0043-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.010

2015-05-04

山东省科学院青年基金项目资助（2013QN018）；山东省自主创新专项项目（2013CXC20605）

陈泉（1981-），男，助理研究员，博士，研究方向为微生物代谢。

*通讯作者：李纪顺（1971-），男，高级工程师，本科，研究方向为应用微生物。