UPLC-MS/MS法测定婴幼儿乳制品中的氟乙酸钠

张文旭，胡 雪，高玉杰，张立佳

（1.内蒙古医科大学附属医院，内蒙古呼和浩特010050；2.内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古呼和浩特010110）

UPLC-MS/MS法测定婴幼儿乳制品中的氟乙酸钠

张文旭1，胡 雪2*，高玉杰2，张立佳2

（1.内蒙古医科大学附属医院，内蒙古呼和浩特010050；2.内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古呼和浩特010110）

采用超高效液相色谱-串联质谱法建立了婴幼儿乳制品中氟乙酸钠的检测方法，为相关中毒事件的样本分析提供检测依据。样品经水稀释、乙腈沉淀蛋白、C18固相萃取填料净化后，低温冷冻离心除掉杂质，含0.1%乙酸水溶液和乙腈梯度洗脱，通过ACQUITY UPLC CSH Fluoro-Phenyl色谱柱分离，电喷雾负离子多反应监测模式进行检测。结果表明，该方法在10～1 000 μg/L范围内线性良好，相关系数R2＞0.99，定量限0.2 mg/kg。不同添加质量浓度的回收率为91.8%～114.9%，相对标准偏差＜10.0%，精密度试验相对标准偏差＜5.0%。该方法操作快速简单、灵敏度和重现性较好，能够用于婴幼儿乳制品中氟乙酸钠的污染排查和相关中毒事件的样品检测。

超高效液相色谱质谱联用法；氟乙酸钠；中毒检测；婴幼儿乳制品

氟乙酸钠是一种剧毒物质，常被作为杀鼠剂使用。虽然我国卫生部于1982年已经明令禁止其生产、销售和使用，但是近年来依然有很多例误食或投毒引起的氟乙酸钠中毒事件。氟乙酸钠中毒机制已经有了很多研究[1-3]，主要为在体内形成氟乙酸，进而与柠檬酸结合形成氟柠檬酸，抑制乌头酸酶，导致三羧酸循环中断，氟柠檬酸在组织中蓄积，肾、心、脑组织中可分别增高80、20、8倍。脑细胞钠钾泵衰竭、细胞内水肿，同时过多的氟柠檬酸可直接损害神经细胞而造成脑功能障碍。心脏、肝脏、肾脏也可能由此造成不同程度损害。婴幼儿由于各种器官耐受程度均低于成人，因此在氟乙酸钠中毒抢救中起病更急、病死率更高。关注婴幼儿乳制品中的毒物污染情况并研究该类食品中氟乙酸钠快速、准确的检测方法具有重要的实际意义。

文献报道的氟乙酸钠含量分析检测方法有离子色谱法[4]、毛细管电泳法[5]、液相色谱法[6]、气相色谱法[7]、气相质谱法[8-9]、液相质谱法[10]等。近年来，超高效液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法在复杂样本痕量检测中的应用越来越广泛，避免了由于衍生步骤而降低的方法稳定性。但是液质法对基质效应的要求比较高，因此对前处理方法的选择十分重要。文献报道的方法涵盖了不同的检测样品，如鼠药[11-13]、胃内容物[14]、血液[15]、其他生物样品[16-18]、植物[19]、酱油、醋[20-21]等，但是其前处理方法不适用婴幼儿乳制品的检测。婴幼儿乳制品包括乳粉、儿童奶、儿童发酵乳以及冷冻饮品等，样品蛋白质含量高，基质复杂，需要最大程度的去除基质干扰并能保证回收率。本研究拟利用一种简单并适用于多种婴幼儿乳制品的前处理方法结合超高效液相色谱质谱联用法实现对婴幼儿乳制品中污染物氟乙酸钠的快速、高效、准确排查和相关中毒事件的样品检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

婴幼儿乳粉、QQ星儿童奶、QQ星儿童风味发酵乳、冷冻饮品：内蒙古伊利实业集团股份有限公司。

氟乙酸钠标准品（纯度≥98%）：德国Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司；乙酸（色谱纯）、乙腈（色谱纯）：德国Merck公司；C18固相萃取填料：美国Sepulco公司；Oasis HLB固相萃取柱（500mg/6mL）、Sep-PakC18固相萃取柱（500mg/6mL）：美国Waters公司。

1.2 仪器与设备

SIGMA3K30低温高速离心机：德国Sigma公司；Waters Acquity TQ Detector超高效液相色谱质谱联用仪：美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理方法

称取试样1.0 g于50 mL的具塞离心管中，加4 mL超纯水稀释，再加入10 mL乙腈和0.5 g C18固相萃取填料，涡旋混匀，超声10 min，4℃、16 000 r/min离心10 min。取上清液于50 mL烧杯中，加入15 mL超纯水，混匀，过0.22 μm滤膜，供液相色谱质谱仪进样分析。

1.3.2 空白基质标线的制备及添加回收率

准确称取氟乙酸钠约10 mg（精确至0.1 mg），用50%乙腈水溶解并定容至10 mL，按纯度折算其质量浓度，配制成1 000 mg/L的标准储备液。

取与待测样同样基质的阴性样品，按照和待测样品相同的前处理方法得到空白基质液，用该空白基质液配制成质量浓度为10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、500 μg/L、1 000 μg/L的标准工作液，上机后得到空白基质标线。

添加回收率试验，在阴性样品中添加一定质量浓度的标准溶液，混匀后按照样品前处理方法进行处理，上机后得到的结果与理论添加值的比值，即为回收率。每类样品选择具有代表性的样品进行回收率试验，每个添加水平做6次平行试验，取平均值。

1.3.3 色谱条件

1.3.4 质谱条件

电离模式：电喷雾离子源（electronic spray ion，ESI）；毛细管电压2.2 kV；锥孔电压30 V；碰撞电压10 V；源温120℃；脱溶剂温度350℃；脱溶剂气流量600 L/h；碰撞室压力0.31 Pa。多反应监测方式检测，母离子m/z76.74，定量子离子m/z57.06，定性子离子m/z49.09。

1.3.5 氟乙酸钠的含量计算公式

式中：X为试样中氟乙酸钠的含量，mg/kg；C为由标准曲线得到的上机液中氟乙酸钠的质量浓度，μg/L；D为样品的定容体积乘以稀释倍数，mL；m为试样的质量，g。

2 结果与分析

2.1 沉淀剂的选择

氟乙酸钠的亲水性极强，在传统的反相液相色谱柱上保留很弱，易与溶剂共流出，因此选用ACQUITY UPLC CSHRFluoro-Phenyl色谱柱进行分离[21]。

乳制品常用的蛋白沉淀剂有酸和有机溶剂，由于氟乙酸钠极易溶于水而不溶于有机溶剂，所以在选用有机溶剂时要选择合适的比例。经过优化试验，体积分数＜50%乙腈作为沉淀剂时，上清液浑浊，沉淀不完全；＞80%乙腈作为沉淀剂时，因水相体积分数较小，提取不彻底，影响回收率，甚至有时会出现分层现象，因此乙腈体积分数在50%～80%较为适宜。

由图1a可知，氟乙酸钠标准品的出峰时间为2.18 min。由图1b可知，用10 g/L三氯乙酸或1%乙酸作为沉淀剂时，上清液较清，但是氟乙酸钠在色谱柱上没有保留（pH值从2调至4、6、8现象一样）。由图1c可知，用体积分数为65%乙腈作为沉淀剂时，上清液较清，在色谱柱上同样没有保留，通过加水使乙腈含量降至30%，则氟乙酸钠在色谱柱上保留良好，并且与标品出峰时间一致。因此，选择体积分数为65%的乙腈作为沉淀剂，并在上机前用水稀释至30%。

2.2 固相萃取方式的选择

质谱基质效应的影响因素有很多，固相萃取是液质检测中常用的前处理方式以消除或减弱基质效应。用每种空白基质配制的标准工作液（1.3.2）与用体积分数为20%的乙腈配制的标准工作液进行比较，二者峰面积做比值，即为基质效应。比值＞100%的有基质增强作用；比值＜100%的有基质抑制作用。但是由于氟乙酸钠在反向固相萃取柱上的保留性极弱，因此该类固相萃取柱只能用作净化柱使用。对氟乙酸钠最佳的固相萃取方式是选用阴离子交换柱[4，7-8]，但是由于洗脱液通常用酸，因此该类前处理适用的上机仪器为离子色谱或气相色谱，用液质仪器同样会发生色谱柱上没有保留的现象。分别用C18固相萃取填料0.5 g、Oasis HLB固相萃取柱（500 mg/6 mL）和Sep-Pak C18（500 mg/6 mL）固相萃取柱来净化，发现其基质效应均可控制在90%～120%（儿童奶、儿童发酵乳、冷冻饮品）和60%～100%（婴幼儿乳粉）。用C18固相萃取填料可与沉淀离心的步骤合并，减少了活化、上样、淋洗、洗脱等固相萃取步骤，节省了前处理时间，因此选择添加C18固相萃取填料为净化方式。

2.3 进样体积的选择

超高效液相色谱由于其流速为300 μL/min，因此存在溶剂效应，即上机液的定容液种类和进样体积均会对色谱柱的分离造成一些影响。定容液为体积分数30%的乙腈溶液，低于初始流动相中乙腈的含量。进样体积分别选择2 μL、5 μL和10 μL，由图2可知，进样体积为2 μL时没有溶剂效应，峰型较好。因此，选择进样体积为2 μL。

2.4 标准曲线、线性范围、定量限及基质效应

儿童乳制品主要有4类，分别为婴幼儿乳粉、儿童奶、儿童发酵乳和冷冻饮品，用这种空白基质配制标线，峰面积（Y）和质量浓度（X）标准曲线回归方程及相关系数详见表1。

定量限以最低加标浓度试样中氟乙酸钠的定量色谱峰信噪比为10时计算所得，方法的定量限为0.2 mg/kg。由表1可知，该方法在10～1 000 μg/L范围内线性良好，相关系数R2均＞0.99。考查添加质量浓度为20 μg/L时的基质效应，其中婴幼儿乳粉的基质效应比较明显，其他三种基质效应较弱。因此婴幼儿乳粉需要用空白基质配制标准曲线进行定量测定。

2.5 准确度和精密度试验

在婴幼儿乳粉、儿童奶、儿童发酵乳和冷冻饮品的阴性样品中加入不同质量分数的氟乙酸钠，平行测定6次，得出平均回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果如表2所示。

从表2可知，测定不同婴幼儿乳制品基质中氟乙酸钠的平均回收率为91.8%～114.9%，相对标准偏差＜10.0%，说明该方法的准确度好，能满足定量分析的要求。

对加标的婴幼儿乳粉和儿童奶平行测定6次，结果见表3，RSD值分别为2.6%和1.1%，说明该方法的精密度良好，能满足定量分析的要求。

3 结论

本研究通过对沉淀剂、固相萃取方式及进样体积等前处理条件的优化，实现了用超高效液相色谱质谱联用法对婴幼儿乳制品中氟乙酸钠的直接测定。与现有的报道相比，本方法的定量限为0.2 mg/kg，处于相当的水平，同时避免了衍生反应引起的不稳定性及检验周期长的缺点。该方法在10～1 000 μg/L范围内线性良好，相关系数R2＞0.99，不同添加质量浓度的回收率为91.8%～114.9%，相对标准偏差＜10.0%，精密度试验相对标准偏差＜5.0%。该检测方法简单快速且易于操作，精密度及准确性良好，适合对婴幼儿乳制品实现氟乙酸钠污染的排查，并可用于该类中毒样品的快速检测。

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Determination of sodium fluoroacetate in infant dairy products by UPLC-MS/MS

ZHANG Wenxu1,HU Xue2*,GAO Yujie2,ZHANG Lijia2
(1.Affiliated Hospital,Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010050,China; 2.Inner Mongolia Yili Industrial Group Co.,Ltd.,Hohhot 010110,China)

A UPLC-MS/MS method for determination of sodium fluoroacetate in infant dairy products was developed and the analytical method for the relevant food poison accidents was provided.Samples were ultrasonically extracted with water,protein was precipitated by frozen with acetonitrile and the extracted solution was purified by dispersive DSC-C18.The target compound was separated by ACQUITY UPLC CSH Fluoro-Phenyl with a mobile phase of 0.1%acetic acid solution and acetonitrile,and analyzed by a negative electrospray ion multiple reaction monitoring mode.The standard curves were linear in the concentration range of 10-1 000 μg/L with correlation coefficients more than 0.99.The quantification limits was 0.2 mg/kg.The recovery values and the relative standard deviation were 91.8%-114.9%and less than 10.0%at different fortification levels.Due to its simplicity,relatively high sensitivity and reproducibility,the method was suitable for the contamination screening and detection of sodium fluoroacetate in infant dairy products from the poisoning accidents.

UPLC-MS/MS;sodium fluoroacetate;poisoning test;infant dairy products

R917

A

0254-5071（2015）06-0150-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.033

2015-05-25

“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAK17B00）

张文旭（1981-），男，药师，本科，研究方向为药物分析。

*通讯作者：胡雪（1981-），女，工程师，硕士，研究方向为分析检测。