荧光定量PCR技术在临床微生物检测中的应用

王 宇 靳伟东 兰 凯 刘天尧

荧光定量PCR技术在临床微生物检测中的应用

王 宇 靳伟东 兰 凯 刘天尧

目的探讨荧光定量PCR技术在临床微生物检测中的应用。方法选取医院收治的门诊及住院102例患者的临床标本，利用荧光定量PCR技术对微生物进行检测，观察微生物检测结果。结果脓液标本中，检出金黄色葡萄球菌4株；在大便标本中，检出沙门氏菌21株、肠出血性大肠杆菌O157：H7 2株、副溶血性弧菌12株；荧光定量PCR技术检测临床微生物特异性和灵敏度良好，精确定量。结论荧光定量PCR技术具有特异性高、灵敏度好、精确定量的优点，检测结果良好。

荧光定量PCR技术；临床微生物检测；特异度；灵敏度

荧光定量PCR技术是指将荧光基团加入PCR反应体系中，通过荧光信号累积，对整个PCR过程进行实时监测，最终，利用定量分析法，在标准曲线的基础上分析未知模板［1］。荧光定量PCR技术具有灵敏、快速、精确定量的优点，广泛的应用在临床微生物检测方面。本院以收治的102例患者为研究对象，采用荧光定量PCR技术对其标本进行微生物检测，取得良好效果，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

以医院2013年7月～2014年7月收治的门诊和住院患者102例为研究对象，男65例，女37例；年龄18～83岁，平均（42.8±5.7）岁；泌尿系感染13例，细菌性食物中毒8例，上呼吸道感染34例，流行性感冒32例，肾盂肾炎9例，慢性阻塞性肺病6例。102份标本中，粪便63份，脓液39份。

1.2 方法

所有患者获取的标本均采用荧光定量PCR技术检测，在1.5 ml的灭菌Epp管中，滴入1.5 ml样本增菌液，振荡混匀，高速离心机离心2 min。将上清清除干净，剩余沉淀中直接加入100 μl DNA提取液，充分的混合均匀后，沸水浴（10±1）min，高速离心机离心5 min，将上清取出4 μl，进行PCR反应；利用PCR检测仪，给予扩增检测；依据试剂盒说明书，配制反应混合液，同时，设置循环参数、阳性梯度模板、阴性对照，判定结果时，严格按照检测仪和试剂盒说明书来进行。微生物菌分离完成后，各取5株进行试剂盒特异性检测。菌株检测阳性后，进行10倍梯度稀释，在试剂盒说明书的指导下，扩增PCR，分析试剂盒的灵敏度。泛，可准确的检测出多种病毒。在B型肝炎病毒检测中，以多份不同基本型混合的样本为检测对象，对其中混合的基因型进行检测，经检测结果可知，所有混合的基因型均可被检测出来，由此说明，荧光定量PCR技术具有比较高的精确度［2］。在对手足口病患者进行临床诊断时，利用传统ELISA法和荧光定量PCR技术对患者标本进行检测，结果显示，荧光定量PCR技术的检测速度快，能够准确的检测出手足口病［3］。

3.2 细菌检测中的应用

近年来，荧光定量PCR技术在细菌检测中的应用越来越广泛，在TaqMan荧光定量PCR技术的基础上，形成了检测结合分枝杆菌的方法，此种方法的灵敏度达到90%以上，特异性100%，高于传统的图片染色法和培养法［4］。利用荧光定量PCR技术检测沙门氏菌的ompF基因，其所包含的所有种型均可以被检测出来，具有非常高的灵敏度和特异性，且检测时间比较短，能够快速的形成检测结果，提升了检测效率［5］。

3.3 在真菌检测中的应用

在真菌的检测和鉴定中，荧光定量PCR技术也具有比较多的应用。针对曲霉菌的18SRNA序列设计引物和探针对疑似临床样本进行检测，并进行特异性检测，结果显示，特异度为100%，能够实现精确检测［6］。

3.4 小结

当前，在部分微生物检测中，FDA和CFDA已经认可荧光定量PCR检测技术。随着荧光定量PCR技术的不断完善，临床微生物检测中越来越多的应用此种检测方法，可准确的检测出各种微生物，为临床有效治疗提供良好的依据，提升临床治疗效果。

2 结果

在63份粪便标本中，检出沙门氏菌21株，阳性率为33.3%，肠出血性大肠杆菌O157：H7 2株，阳性率为3.2%，副溶血性弧菌12株，阳性率为19.0%。在39份脓液标本中，检出金黄色葡萄球菌4株，阳性率为10.3%。

选取沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌O157：H7、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌阳性菌株各5株，利用试剂盒检测特异性，结果显示：特异性100%，无假阳性或假阴性检出。

对沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌O157：H7、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌菌株进行10倍系列系数检测PCR技术灵敏度，结果显示：102拷贝/ml核酸样本为可进行的最低核酸检测限度。

3 讨论

3.1 在病毒检测中的应用

在当前的病毒检测中，荧光定量PCR技术已经应用的比较广

［1］ 李海红，侯锡苗. 实时荧光定量PCR技术及其在几类病原体检测中的应用［J］. 职业与健康，2015，31（18）：2586-2589.

［2］ 杨洪毅，石洁，刘国栋，等. 荧光定量PCR技术在痰结核菌检测中的应用［J］.现代预防医学，2013，40（8）：1483-1484.

［3］ 郭丹桂，许少洪. 实时荧光定量PCR技术在疫情和食物中毒检测中的应用［J］. 职业与健康，2013，29（21）：2857-2858.

［4］ 周晓红，徐佩华，孙明华，等. 实时荧光定量PCR技术在食源性致病菌快速检测中的应用［J］. 上海预防医学，2014，26（6）：313-317.

［5］ 郑志芬，戴荣继. 实时荧光定量PCR技术在临床肿瘤检测中的应用［J］. 生命科学仪器，2014，12（3）：20-23.

［6］ 刘小荣，张笠，王勇平. 实时荧光定量PCR技术的理论研究及其医学应用［J］.中国组织工程研究与临床康复，2010，14（2）：329-332.

Fluorescence Quantitative PCR Technology in Clinical Application of Microbiological Detection

WANG Yu JIN Weidong LAN Kai LIU Tianyao The Prison Administration Center Hospital of Heilongjiang Province，Harbin 150080，China

Objective To study the fluorescence quantitative PCR technology in clinical application of microbiological detection.MethodsTo select 102 clinical specimens from outpatients and inpatients in our hospital，using the fluorescent quantitative PCR technology for microbial testing，observation of microbial test results.ResultsThe pus，check out the 4 aureus strains. In the fecal specimen，21 strains of salmonella， 2 strains of e.coli O157：H7，12 strains of deputy hemolytic vibrio. Fluorescence quantitative PCR technique to detect the clinical microbiology had specificity and sensitivity，and had good precision quantitative.ConclusionThe fluorescence quantitative PCR technique with high specificity，sensitivity，the advantages of accurate quantitative widely applied in clinical microbiology tests.

Fluorescence quantitative PCR technique，Clinical microbiological detection，Specific degrees，Sensitivity

中图分类号】R459.7

A

1674-9316（2015）30-0151-02

10.3969/j.issn.1674-9316.2015.30.113

150080哈尔滨，黑龙江省监狱管理局中心医院