干酪微观结构观察方法与研究进展

朱军伟，杭锋，王钦博，穆海菠，郭本恒

（光明乳业股份有限公司，乳业生物技术国家重点实验室，上海200436）

0 引言

干酪是一款功能多样、营养丰富的乳制品，可以作为主食、甜品、零食、调味品，或者是作为其他食品的一种组分，现有品种已经超过500种。这类乳制品是蛋白质、维生素和矿物质（特别是钙和磷）的良好来源。因此，干酪成品品质的评价极其重要，主要包括风味、理化和功能特性（质构和熔化特性），对于这些功能性的预测及控制需要理解不同功能组分的定位以及他们之间的相互作用，这就需要我们研究生产和贮藏过程中干酪微观结构的变化[1,2]。干酪微观结构的常规检测方法有光学显微镜(LM)，共聚焦激光扫描显微镜(CSLM)，电子显微镜（EM）如扫描电镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）[3,4]等技术。与LM和CSLM技术相比，EM技术的主要优点是可以获得干酪组分分辨率更高的成像，也是目前应用最为广泛的微观分析技术。本文综述了利用显微镜技术研究干酪微观结构的观察方法与最新进展，旨在为该方向研究提供借鉴。

1 研究方法

1.1 光学显微镜技术（LM）

光学显微镜（LM）技术在干酪微观结构分析中常被用来快速获取定量和定性的信息[5]，这是LM技术的主要优点。传统的LM技术包括明视野、偏振光、荧光和共聚焦显微镜技术。在干酪微观结构分析中，共聚焦显微镜技术最常被用到。然而，光学显微镜技术在对干酪样品做前处理时，势必会用到各类染色剂，这也极有可能导致一些假象的产生；另外，在干酪受到冷冻、加热或冷却时，也会对微观结构产生一定的影响，这也是光学显微镜技术最大的缺点。

1.1.1 明视野显微镜技术

在镜检前需对干酪样品进行前处理工作，样品须被切分成5 μm厚度。为使样品具有刚性便于切片，可以使用酒精脱水后的树脂对样品进行包埋，也可以直接将样品冷冻。利用第一种方法对样品包埋后，再用玻璃超薄切片机分段[6]。目前，干酪微观结构分析中常用到的前处理方法是冷冻切片。小的长方形样品用冷冻保护剂（如最佳切割温度复合物OCT）包埋后，置于液氮冷冻。之后，样品在-30℃冷冻切片机中被切片[1,2,7-8]。这两种方法获得切片后，需用甲醛或戊二醛进行固定，固定好的切片再对脂质、蛋白质及其他组分如淀粉、碳水化合物等进行染色。

特异性染色剂可以用来鉴定干酪体系中蛋白质、脂肪和碳水化合物等组分。蛋白质的染色剂最常用的是固绿、丫啶橙和亚甲基蓝，而脂肪染色剂常用的则是油红O和苏丹红。碘常和蛋白质与脂肪染色剂结合起来使用来鉴定淀粉等碳水化合物[9]。

1.1.2 偏振光显微镜技术

在偏振光显微镜技术分析干酪微观结构中，干酪样品的前处理方法和明视野显微镜技术基本一致。偏振光显微镜技术用于检测具有双折射结构的食品组分，如有序的结晶结构。当偏振光通过双折射材料时，光线会在不同的平面和轨道上以不同的速度振动[10]。双折射材料在黑暗的背景下会很明亮或是呈现一定的颜色。

许多干酪组分都是双折射结构，如脂肪和碳水化合物[1,2]。在偏振光显微镜下观察成品干酪样品，可以分析其淀粉是否已经糊化。干酪淀粉在未糊化状态下并不会呈现双折射结构，因此无法成像，但是当干酪经微波加热后，淀粉糊化，此时可在偏振光显微镜下观察到双折射结构[11]。与明视野显微镜技术相比，偏振光显微镜技术的优点是无需对样品染色，但是此技术有很大局限性，仅能检测分析干酪组分中的双折射结构。

1.1.3 荧光显微镜技术

荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光（如紫外光λ=3650或紫蓝光λ=4200）作为激发光、激发样品内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断(或压制)滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛，二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩[12]。

在干酪微观结构分析中使用荧光显微镜技术同样需要对样品进行前处理，这也是这种方法的主要缺陷。与其他显微镜技术相比，荧光显微镜技术的灵敏度更高，最小可以检测10-18mol的荧光化合物[13]。荧光大多来源于特异性化学染料，但也必须在特定的化学环境中进行染色。例如，尼罗红（脂溶性染料）和尼罗蓝（水溶性染料）在疏水性介质中遇到干酪中的脂肪球和蛋白质时会在极短时间内分别发射出较照射波长更长的可见荧光[14]，因而可以鉴别脂肪和蛋白质的分布。现如今，由于荧光染色技术已经广泛应用于共聚焦显微镜分析技术中，因此荧光显微镜技术在干酪微观结构分析中并不常用。

1.1.4 共聚焦激光扫描显微镜技术

共聚焦激光扫描显微镜技术（CSLM）是研究分析乳制品尤其是干酪微观结构中最常用的显微镜技术之一[15-16]。由于激光扫描能穿透干酪表面使得光学薄片可视化，从而在不打乱内部结构的情况下对干酪微观结构进行三维立体分析。与LM技术相比，CSLM不必对干酪样品进行切分前处理，因此可以避免产生一些假象。然而，CSLM技术的缺点是设备购买和维护费用极高[12]。

标准的CSLM装备有氩离子激光或氦氖离子激光发射器，其所拍摄到的图像的清晰度可以达到几百微米。Ong等[4]利用CSLM技术还原了切达干酪的三维结构图，使得分析更为具体和形象。据报道[17,18,19]，利用特异性的荧光或者染料可以鉴定一些干酪组分如蛋白质和脂肪，还可以定位一些微生物的位置。干酪微观结构分析中最常用的荧光染料为固绿、若丹明和异硫氰酸荧光素（蛋白质），油红O和尼罗红（脂肪）[20]。

1.2 电子显微镜技术（EM）[1,2,4,7-8]

与光学显微镜相比，电子显微镜的分辨率可以达到0.1～5 nm，因此，当需要获取高分辨率图像时，通常使用电子显微镜技术，如为了分析干酪中蛋白质的精细结构时。目前在干酪微观结构分析中常用的电子显微镜技术为扫描电子显微镜技术（SEM），某些时候也会用到透射电子显微镜技术（TEM）。这两种方法的不同点在于样品的前处理，这也导致了他们所应用的范围不同。

1.2.1 扫描电子显微镜技术（SEM）

1.2.1.1 传统SEM

电子枪产生的电子束与物质相互作用后发射出大量放射性物质（二次电子），通过对二次电子的采集可以得到有关物质微观形貌的信息[21]。此项技术必须在真空环境下进行，且样品必须彻底干燥，这样才能产生样品微观结构信息的清晰图像。为了能够收集到更多的二次电子，有必要在样品表明涂上一层导电层来防止发生充电现象。

扫描电镜技术应用于干酪微观结构分析已经有很长一段时间了。一束高能的入射电子轰击干酪表面时，被激发区域产生的大量二次电子，再通过检测器收集，最后生成结构图像。干酪在进行SEM分析前需对样品做以下前处理[22]。利用刀片将干酪切分为矩形状，然后分别用戊二醛溶液固定、酒精梯度脱水、氯仿脱脂。接着在液氮中冷冻断裂，最后用液态二氧化碳临界点干燥仪干燥。干燥后的切片样品固定在操作台，用离子溅射仪在样品表面镀一层20～30 nm的金膜。如果重点观察脂肪变化，则在使用戊二醛固定前，先用四氧化锇咪唑缓冲液固定，且无需进行脱脂操作。此外，样品制备需在低温下进行以防止破坏脂肪球。然而在样品制备时所用到的酒精和冷冻操作，会对干酪的结构造成轻微的损伤或断裂，这也是SEM主要的一大缺点[23]。干酪微观结构最新研究报道中，关注的重点在细菌细胞组分而不是脂肪，因此酒精梯度脱水成为研究热点[16,24]。这一步可以在不打断重叠脂肪球的情况下，帮助定位干酪结构中的细菌细胞所处位置。样品制备完成后，在5～15 V加速电压及500～10 000放大倍数下，立即进行扫描电镜观察。

1.2.1.2 冷冻SEM（cryo-SEM）

常规扫描电镜要求所观察的样品无水，而一些样品在干燥过程中会发生结构变化，致使无法观察其真实结构，冷冻扫描电镜(Cryo-SEM)就是在传统的SEM基础上增加一个冷冻台，这样可实现直接观察液体、半液体及对电子束敏感的乳制品的微观结构，如酸奶、冰淇淋以及绝大多数干酪[25]。

这项技术整个样品检测过程温度必须控制在-80℃以下。由于低温扫描电子显微镜简化了样品制备过程且降低了电镜级化学品的消耗，这项技术已经应用于干酪微观结构的检测分析研究中。例如，cryo-SEM更适用于分析全脂干酪，尤其是脂肪组分容易在脱水或脱脂过程中发生变化的干酪。然而，据报道[1]，成品干酪cryo-SEM分析过程中的低温有可能会导致干酪收缩，进而影响到蛋白质的结构成像。

近来，cryo-SEM已被广泛应用于成品切达干酪的微观结构分析研究中。简要的过程如下。1 mm×3 mm×5 mm的干酪块置于载物台上迅速置于液氮中（-210℃）冷冻固定。样品随即转移到-180℃真空冷冻室中，待样品表面断裂后，用离子溅射仪在样品表面镀一层20～30 nm的金膜，使其具备一定的导电性，最后在显微镜下以5～15 V加速电压及500～10 000放大倍数下，立即进行扫描电镜观察。从获取的电镜图像可以鉴别淀粉颗粒，因为这些颗粒大都为球形且与蛋白质相分离，比脂肪球尺寸更大[2,16]。

1.2.1.3 环境SEM（ESEM）

ESEM与传统SEM不同点在于ESEM在微观结构观察时需要提供一个气态环境。传统SEM需要在真空环境下完成检测，而ESEM的优点在于样品可以在一个相对较高的压力环境下检测，而且不需要样品完全干燥[26]。这意味着如果水蒸汽是样品室中使用的气体，那么含水的样品在必要的前处理后不需要再做其他改变就可以在其原生状态下成像。ESEM还有一个优点是样品不受超低温影响，因而高分辨率显微镜技术不会受到消极影响。

目前，ESEM技术已被用于一些干酪微观结构的研究中。从天然干酪的显微照片中可以观察到其结构紧凑、粗糙，结构间有非常微小的间隙[27]。成品干酪中，Noronha等[1]发现利用cryo-SEM和ESEM所得到的微观结构存在一定的差异，并解释了产生差异的原因在于样品前处理的要求不一样。ESEM显微照片显示蛋白质基质呈多孔状，而cryo-SEM的显微照片中蛋白质基质表面是平滑的。然而，与cryo-SEM相比，ESEM在鉴别淀粉和脂肪球结构方面没有太大的用处，这也是ESEM技术在干酪微观结构分析中的一大缺陷。

1.2.2 透射电子显微镜技术（TEM）

透射电子显微镜技术基本原理是电子束穿过样品室内样品时会携带有样品的内部结构信息，TEM的成像设备使用这些信息来成像。因此，为了获得分辨率较高的电子显微图像，样品厚度必须非常薄（0.1～0.2）[28]，在制备干酪样品时就必须使用到薄切片技术。

Reis等[29]为了能够利用薄切片技术，将大约1 mm×1 mm×1 mm大小的干酪先用化学试剂进行包埋和固定（此步骤与传统SEM基本一致），后再用超薄切片机将样品切分到0.1～0.2 μm，最后将薄切片置于铜载网上用2%醋酸双氧铀溶液和柠檬酸铅染色，但是在进行显微观察时必须使用更高的加速电压（50～70 kV）。

利用TEM技术分析干酪微观结构的主要优点在于它能获得比其他显微镜技术更高分辨率的图像，这将有利于应用图像处理软件做进一步分析，因而所获取的结果具有更高的准确性和一致性[29]。然而，TEM技术也有一些劣势限制其广泛应用，如易产生假象、样品制备复杂、耗时且耗费高[30]。

1.3 其他显微镜技术

国内外有一部分学者为了获取矿物质如钙、磷、钠和钾等在干酪中的分布，将显微镜技术与其他分析技术结合起来做了一些研究。如能量过滤透射电镜技术（Energy Filtered Transmission Electron Microscopy，EFTEM）[31]，能量过滤器的使用可以提高能量分辨率，对于微区内元素的分布等分析更加精确，它是研究干酪矿物质在显微结构中分布的有用手段，也是目前国内外研究的一大热点。最近，傅里叶变换红外成像技术（FTIR）也被用来分析干酪微观结构[1]。此法获得的图像对于干酪中蛋白质、脂肪和淀粉的分布提供了很有价值的信息。但是，作者并没有对干酪做进一步关于定量的研究。

2 结论与展望

本文综述了干酪微观结构的研究分析方法及研究进展，主要包括光学显微镜技术和电子显微镜技术，并比较和阐述了各自方法的优缺点和相关操作流程，希望能给干酪微观结构研究的工作者提供一些理论支持，进而结合实际找到适合自己研究的显微镜技术。干酪微观结构的研究，未来可以从以下几方面着手开展。

首先，有必要对于干酪微观结构中矿物质元素的分布做更为系统的研究，如运用LM和CSLM技术，还有EFTEM技术，从而建立一套完整且系统的矿物质元素分布的研究方法。

其次，细菌在干酪中的分布及其对干酪品质的影响已经成为当下的研究热点。如何在干酪样品制备过程中最大程度减小对细菌的破坏，成为这类研究的关键。

最后，还应该将这些研究方法所得到的结果与干酪不同成熟阶段所表现的现象联系起来，从而更加科学的解释其功能性质。

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