天然生物碱单体在结肠癌领域中的研究进展

郭 毅 李慧颖 王 磊

(吉林大学白求恩第一医院结直肠外科，吉林 长春 130021)

结肠癌早期临床症状隐匿，且缺乏早期诊断靶标，就诊时已多为晚期，失去手术治疗机会，因此化学药物治疗在结肠癌的临床治疗中占有重要地位。目前应用于结肠癌的一线化疗药物主要为氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康等〔1，2〕。肿瘤细胞对化学药物的耐药现象普遍存在于结肠癌的化疗过程中，严重制约着这些化疗药物的临床疗效〔3〕。天然生物碱单体具有抗炎、抗氧化、解热镇痛、抗肿瘤等多种生物学活性〔4〕。天然化合物与传统化疗药物相比具有毒副作用小、缓解肿瘤患者疼痛等独特优势，因此现已被广泛应用于结肠癌的治疗方案中。研究发现生物碱单体对肿瘤细胞的作用机制主要涉及抑制微管蛋白活性，抑制拓扑异构酶活性，诱导细胞凋亡及细胞周期阻滞，促进肿瘤细胞分化，抑制肿瘤细胞增殖，改变肿瘤细胞膜特性，增强机体免疫功能等多种途径实现。本文将近年来报道的生物碱单体在结肠癌领域中的研究进展按其结构分类进行综述。

1 吡啶类生物碱

吡啶类生物碱由吡啶和哌啶衍生而成，又被分为简单吡啶类和双稠哌啶类。其中简单吡啶类生物碱包括烟碱、槟榔碱、胡椒碱等，其中以胡椒碱在结肠癌领域中的研究报道最多。胡椒碱是胡椒中重要的活性成分，经人体摄食后不仅促进胰酶的分泌，增强胃肠消化功能，兼具抗炎、止痛、退热、抗氧化等多种药理活性。最近在结肠癌相关研究中发现将胡椒碱作用于结肠癌细胞株(HT-29)细胞，可以显著抑制肿瘤细胞的增殖，其抗癌机制涉及由cyclin D1/D3，CDK4/6及P21、P27介导的细胞周期G1期阻滞。此外，胡椒碱可以通过上调活性氧(ROS)生成，激活内质网应急相关蛋白，阻断蛋白激酶(AKT)的磷酸化及c-Jun氨基瑞激酶(JNK)、丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)的激活，最终诱导细胞发生caspase介导的线粒体凋亡〔5〕。

双稠哌啶类生物碱包括苦参碱、金雀花碱等，以喹诺里西啶基本母核为主要特征。吡啶类生物碱的抗癌活性以苦参碱为代表，现已得到了广泛认可。苦参碱是一类广泛存在于豆科植物苦参的双稠哌啶类生物碱，是目前在肿瘤领域中研究最多的生物碱之一。在HT-29细胞体外实验中人们发现苦参碱特异性抑制环氧化酶2(COX-2)mRNA及蛋白表达量，从而并阻断前列环素2(PGE2)的表达，从而削弱结肠癌细胞的侵袭转移能力〔6〕。在该过程中，苦参碱介导HT-29细胞和结肠腺癌细胞株(SW620)细胞发生G0/G1细胞周期阻滞，并下调抗凋亡因子Bcl-2，激活Bax，促进细胞色素C的释放，最终触发由caspase介导的线粒体凋亡途径〔6～8〕。近年来随着苦参碱抗癌活性研究的不断深入，人们还发现苦参碱可以下调结肠癌SW1116细胞(hTERT)的表达，减弱端粒酶活性，从而抑制肿瘤细胞的增殖〔9〕。此外，另有文献报道苦参碱对结肠癌Lovo细胞的抗癌作用涉及AKT/PI3K信号通路。在Lovo细胞中苦参碱可以通过AKT信号通路的持续激活，抑制细胞周期相关蛋白cyclinD1的表达，同时上调P21和P27蛋白，介导肿瘤细胞阻滞于G1期，并下调Bcl-2/Bax比例，激活金属基识蛋白酶9(caspase-9)，从而诱导细胞发生凋亡〔10〕。

2 异喹啉类生物碱

异喹啉类生物碱来源于苯丙氨酸和酪氨酸，具有异喹啉和四氢异喹啉基本母核，又分为包括萨苏林在内简单异喹啉，以罂粟碱、去甲乌药酸及蝙蝠葛碱为例的苄基异喹啉和以延胡索乙素、小檗碱为代表的原小檗碱类生物碱等。其中苄基异喹啉类生物碱蝙蝠葛碱为防己科植物蝙蝠葛根茎中提取的苄基四氢异喹啉类生物碱，具有抗炎、镇痛等多种药理学活性。最近报道蝙蝠葛碱可以通过抑制细胞中核转录因子(NF-κB)的激活，下调 NF-κB 下游基因 cyclinD1，COX2，c-Myc，survivin，Bcl-2，X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)等细胞周期和凋亡相关因子的表达水平，削弱结肠癌细胞的增殖能力。同时，蝙蝠葛碱还可以通过下调MMP-9及血管内皮生长因子(VEGF)等蛋白的表达抑制肿瘤细胞得侵袭能力和血管生成，其在结肠癌细胞中的抗癌活性在体内水平也得到了验证〔11〕。

原小檗碱类生物碱代表药物小檗碱也是目前结肠癌领域中研究最多的天然生物碱单体之一〔12〕。小檗碱又名黄连素，是中草药黄连的主要活性成分，具有抗炎以及调节血糖等活性〔13〕。在结肠癌细胞系(SW480)中，小檗碱通过上调P21的表达，介导G2/M期阻滞，并引起细胞色素C的释放，调控Bcl-2家族蛋白，从而导致多聚腺苷酸二磷酸核糖基(PARP)介导的线粒体凋亡。同时，小檗碱可以抑制caspase-8介导的血管生成〔14〕。此外，小檗碱的抗癌活性在多种结肠癌细胞系中得到证实，但对不同的细胞系其发挥抗癌作用的分子机制却略有不同。例如在细胞系(HCT116)中其抗癌活性主要依赖对β-catenin的降解作用从而阻断 Wnt/β-catenin信号通路的异常激活〔15〕，而在SW620细胞中其抗癌活性则主要依赖对JNK/p38 pathway信号通路的抑制作用。此外在HT-29细胞系以及动物模型中小檗碱可以显著抑制COX-2的mRNA及蛋白表达水平，藉此发挥对肿瘤的杀伤作用〔16，17〕。此外最近的研究也发现小檗碱对肿瘤细胞的mTOR/NF-κB以及EGFR信号通路亦具有重要的调控作用〔18，19〕。

喜树碱及其衍生物10-羟喜树碱是重要的抗肿瘤喹啉类生物碱之一。喜树碱最初由Wall等首次从珙桐科植物喜树中提取分离，对人类不同恶性肿瘤具有广谱的抗癌活性。在结肠癌领域的研究中发现喜树碱可以抑制结肠癌细胞SW480和HCT116细胞的异常增殖，其抗癌活性主要通过抑制DNA拓扑异构酶I得以发挥作用。DNA拓扑异构酶在细胞中对DNA复制、修复及转录等生理活动起着重要作用，尤其在肿瘤细胞中过度激活，与其增殖、侵袭等恶性行为密切相关。因此DNA拓扑异构酶I编码基因的错义突变往往与肿瘤对喜树碱的耐药机制密切相关〔20〕。喜树碱类生物碱通过与DNA拓扑异构酶I结合，破坏DNA的拓扑学结构，阻断DNA复制，从而抑制肿瘤细胞的恶性增殖。此外最近的文献报道喜树碱可以特异性抑制ERK蛋白的持续激活，从而抑制HCT116细胞增殖，此作用并不依赖P38及JNK的活性〔21〕。此外人们对不同细胞系对喜树碱的敏感性比较发现，肿瘤细胞对喜树碱的敏感性与JAK2蛋白的活性密切相关〔22〕。

3 吲哚类生物碱

吲哚类生物碱又分为简单吲哚类、单萜吲哚类、色胺吲哚类以及双吲哚类等。其中色胺吲哚类生物碱代表药物吴茱萸碱为植物吴茱萸中提取分离的活性生物碱成分，具有抗氧化、抗炎及抗癌等药理活性。在最近的研究中人们将吴茱萸碱作用于人源结肠癌细胞株(COLO-205)细胞，发现吴茱萸碱可以诱导肿瘤细胞阻滞于G2/M期，同时上调Bax、P53等促凋亡因子的表达，触发细胞线粒体凋亡途径，从而抑制结肠癌细胞的增殖〔23〕。Zhang等〔24〕将吴茱萸碱作用于人结肠癌 lovo细胞，在体内外水平观察其对肿瘤细胞生长的作用发现，吴茱萸碱可以显著抑制lovo细胞生长，并诱导lovo细胞阻滞于S期及凋亡。吴茱萸碱对肿瘤细胞的抑制作用通过荷瘤裸鼠肿瘤试验在体内水平得到验证。

双吲哚类生物碱长春碱是一类由夹竹桃科植物长春花中分离得到的生物碱，因其显著的抗癌作用现已被广泛应用于结肠癌的临床治疗中。迄今人们对长春碱及其多种衍生物的抗癌机制已经有了较深的了解。长春碱的抗癌机制主要通过与肿瘤细胞微管蛋白结合，阻滞微管延长，导致纺锤体形成受阻，从而抑制细胞有丝分裂，使细胞阻滞于分裂中期;同时诱导肿瘤细胞发生线粒体凋亡，抑制新生血管的形成。在结肠癌体外实验中，人们发现长春碱对肿瘤细胞的杀伤作用依赖Bax蛋白的激活，以及Bcl-xL蛋白的聚合作用。而肿瘤细胞对长春碱的敏感性与细胞内c-myc蛋白表达水平密切相关。在最近的实验研究中人们还发现长春碱与其他抗肿瘤药物具有协同作用。例如，抗肿瘤单体黄芪皂甙(AST)与长春碱联合应用具有协同效应，诱导细胞周期阻滞于G2/M期，并抑制结肠癌Lovo细胞中血管生成因子与肿瘤转移蛋白的表达，从而抑制肿瘤细胞的侵袭转移能力。同时研究者在体内试验中发现AST和长春碱的联合应用可以减弱长春碱对血液系统的抑制作用〔25〕。此外在结肠癌细胞株(LS174T)细胞中，长春碱与自噬诱导因子nanoliposomal C6-ceramide的联合应用不仅促进肿瘤细胞发生凋亡，而且通过P62非依赖途径抑制肿瘤细胞自噬小体的成熟从而阻断肿瘤细胞自噬过程〔26〕。

此外二萜类生物碱紫杉醇最早由Wani从短叶红豆杉中分离提取，具有独特的二萜类复杂化学结构。紫杉醇的抗癌活性主要是通过靶向结合微管蛋白特异性位点，抑制微管解聚成亚单位，干扰微管蛋白在细胞有丝分裂中发挥功能，从而抑制肿瘤细胞的增殖，诱导细胞发生凋亡。但肿瘤耐药机制和毒副作用是现阶段制约着紫杉醇临床应用价值的桎梏。因此最近的研究集中在如何逆转紫杉醇耐药和减少紫杉醇毒副作用等方面。有研究发现在SW480及细胞系(DLD-1)中应用MAPK/ERK(MEK)抑制剂PD98059阻断MAPK信号通路的持续激活可以显著增强紫杉醇介导的细胞凋亡，表明MAPK信号通路在紫杉醇诱导的肿瘤细胞凋亡过程中发挥着重要的调控作用〔27〕。该结果在应用siRNA方法特异性抑制MAPK信号通路的试验中也得到了验证。此外另有研究发现在结肠癌细胞HT29-D4中紫杉醇、多西他赛以及长春碱等抗微管蛋白药物对肿瘤的杀伤作用是通过激活 caspase-8来实现的，而非依赖CD95/CD95-L途径〔28〕。结肠癌细胞对紫杉醇的耐药机制涉及多重因素，其中MDR-1、Bcl-2、Bax等蛋白与紫杉醇耐药机制密切相关〔29〕。除此之外，最近研究报道在P53突变的结肠癌HT-29和HCT-15细胞中miR-22的过表达可以逆转肿瘤细胞对紫杉醇的耐药机制，而在P53野生型的HCT-116细胞中miR-22并不能逆转肿瘤细胞对紫杉醇的耐药。进一步深入研究中人们发现miRNA-22逆转肿瘤细胞对紫杉醇耐药机制主要通过抑制Akt在Ser473位点的磷酸化和人黏连蛋白(MTDH)的表达水平，继而上调Bax和caspase-3而实现的〔30〕。

4 吗啡烷类

吗啡烷类生物碱包括吗啡、可待因等。吗啡因其显著的镇痛作用目前广泛应用于结肠癌患者术后疼痛的缓解。最近研究发现在结肠癌HCT细胞中吗啡可以通过抑制细胞间黏附分子(ICAM-1)，血管细胞间黏附因子(VCAM-1)以及E-selectin等肿瘤黏附因子削弱细菌脂多糖介导的肿瘤细胞恶性行为。在结肠癌26-L5细胞中吗啡对肿瘤细胞的黏附能力具有显著的抑制作用。将吗啡拮抗剂纳洛酮作用于该肿瘤细胞发现纳洛酮可以抵消吗啡对肿瘤细胞黏附能力的作用，但对吗啡抑制肿瘤细胞MMP蛋白的作用无明显影响〔31〕。

5 有机胺类生物碱

有机胺类生物碱单体是氮原子不在环内的一类化合物，主要包括麻黄碱、秋水仙碱。近年来，有机胺类生物碱在肿瘤中的研究并不多见。

6 莨菪烷类生物碱

莨菪烷类生物碱通常由莨菪烷环和有机酸缩合成酯，代表生物碱单体有莨菪碱、古柯碱等。此类生物碱在肿瘤领域中的研究鲜见报道。

7 其他生物碱

除上述的几大类生物碱单体以外，亦有其他文献报道多种生物碱单体的抗癌活性。例如，青藤碱可以在多药耐药的结肠癌细胞MDR-Caco-2中，通过下调MDR-1及COX-2基因的表达，抑制NF-κB信号通路，从而逆转结肠癌细胞对化疗药物多柔比星的耐药机制〔32〕。

8 结语

生物碱作为其中重要的一类天然抗肿瘤单体，一直以来受到广泛关注。自1960年第1个植物来源的抗癌生物碱单体长春碱在美国上市以来，越来越多的生物碱单体成分被分离提取，其显著的抗癌活性亦得到广泛认可。多年来人们运用肿瘤药理学技术和方法不断探索这些生物碱发挥抗癌活性的机制，发现天然生物碱单体对肿瘤细胞的抑制作用主要通过抑制微管蛋白聚合，抗微管解聚，抑制DNA拓扑异构酶I的活性，诱导细胞周期阻滞以及触发线粒体凋亡等多种不同机制实现。然而肿瘤发生发展是由多种因素、多阶段复杂的生物学过程，其恶性表型涉及细胞内多种分子的异常表达或功能缺失，因此只有在分子水平不断深入研究抗癌生物碱单体在肿瘤细胞内的具体分子机制，才能为其在结肠癌临床治疗中的广泛应用提供可靠的理论依据。不可否认，由于丰富的中草药学资源，我国在生物碱单体分离提纯方面具有独特的优势，但对其进行深入的机制探索并转化为新药开发等方面与国外先进的技术水平尚有一定差距。因此全面系统的探讨生物碱单体杀伤肿瘤细胞的具体分子机制，找到这些药物发挥作用的靶分子和信号通路，藉此设计出特异性治疗方案，有望为生物碱单体在结肠癌临床治疗中的应用和普及奠定坚实基础。

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