猪繁殖与呼吸综合征诊断方法的研究进展

孙明潭，袁万哲，2，孙继国，2

（1.河北农业大学动物医学院，河北 保定 071001；2.河北省兽医生物技术工程技术研究中心，河北 保定 071001）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种猪繁殖障碍和呼吸道症状的传染病，又称猪蓝耳病。PRRS的传播速度非常快，我国各省相继报道PRRS的发生，并分离到毒株。2006年春、夏季首次暴发由高致病性PRRSV引起的“猪无名高热症”，给我国养猪业造成了重大的经济损失。

我国将PRRS列为二类传染病，高致病性猪蓝耳病列为一类传染病。包括我国在内的世界各国都投入大量的人力物力对该病进行研究，但是对其致病机制和自身复制机制还未能完全明确。因此，快速准确的检测该病显得尤为重要。目前检测的技术手段有：病毒分离（VI），血清学检测，分子生物学检测等方法。本文就PRRSV主要检测技术的最新研究进展作一综述。

1 临床诊断

感染PRRSV的猪群会有不同的临床症状,母猪：发热、厌食、沉郁、昏睡，呼吸困难、咳嗽；流产、死胎、弱仔或早产；产仔率降低、推迟发情、屡配不孕或不发情等，产后无乳等症状。育成猪：双眼肿胀、结膜炎，有眼屎或脓性分泌物，并出现呼吸困难，耳尖发紫、沉郁、昏睡等症状。公猪：感染后表现咳嗽、精神沉郁、食欲不振、呼吸急促，暂时性精液减少和活力下降。仔猪：以1月龄内仔猪最易感染，体温可达40℃以上，呼吸困难、有时腹式呼吸，厌食，腹泻，耳尖至耳根皮肤发绀，出现神经症状，如肌肉震颤，呆立，前肢伸开呈八字脚，运动失调，后肢麻痹，眼睑水肿，死亡率高达80%。对于感染高致病性猪蓝耳病的猪群，多突然发病，且传播迅速。

在病理变化上，蓝耳病会呈现典型的间质性肺炎，肾脏淤血、肿大，病死猪全身淋巴结充血、水肿，脾脏肿大、有出血性丘疹。目前猪群中疾病多为混合感染，仅根据临床症状和剖检很难确诊，因此仍需实验室方法做出最终诊断。

2 实验室诊断

2.1 病毒分离 病毒分离是PRRS最为确切的实验室诊断方法。根据发病猪的生长阶段，病料应选取死胎和发病仔猪的肺、脑、脾、淋巴结、血液等组织匀浆的混合物，母猪的血液，公猪的精液。PRRSV对温度和pH值敏感，因此选取病毒含量高的病料并注意保存和及时送检成为病毒分离的关键。

目前用于分离PRRSV的细胞有：猪原代肺泡巨噬细胞（PAM）、CL-2621、猴肾细胞系Marc-145或MA104。目前主要应用Marc-145进行病毒分离，高致病性PRRSV和部分经典毒株初次分离即可适应Marc-145细胞产生细胞病变（CPE）。而有些经典毒株需先适应PAM之后，才能适应Marc-145细胞，并且不易产生细胞病变（CPE）。因此，在进行病毒分离的同时，还应结合其他实验室方法进行鉴定。并且病毒分离费时费力，因而不能成为普遍应用的方法。

2.2 血清学技术

2.2.1 免疫过氧化物酶细胞单层试验（IPMA）与间接荧光抗体试验（IFA） IPMA需在PAM、Marc-145、CL2621等敏感细胞上进行，特异性和敏感性较好，可以用于PRRSV抗原检测、病毒鉴定、血清抗体检测。但IPMA需配备专门技术人员和相关仪器设备，结果判定受主观因素影响较大，易出假阳性。IFA与IPMA方法基本相似，因此这两种方法没有广泛的应用于临床。

2.2.2 中和试验（VN） VN使用Marc-145细胞在96孔微量板上进行，其特异性较高，可以区分不同病毒类型和确定病毒滴度。由于PRRSV特异性中和抗体产生较晚，导致VN敏感性较低，因此不适宜PRRS早期检测，常用于科研工作中。

2.2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA） ELISA特异性和敏感性高，具有操作简单、标准化、快速、经济、结果判断客观、适宜大规模检测等特点，现已广泛应用，并且在许多国家成为标准或法定的诊断方法。

目前PRRSV常用N蛋白和GP5蛋白作为诊断抗原，为建立多种ELISA的检测方法。其中以GP5蛋白作为诊断抗原不仅能检测野毒感染，而且可以弥补N蛋白作为抗原不能反映机体免疫状况的缺陷[1]。同时，国内外学者相继应用Nsp2、Nsp7、Nsp9等非结构蛋白建立了ELISA检测方法；随着唾液检测技术的发展，国外学者也相继建立了可以检测唾液中PRRSV抗体的ELISA方法，尤其IgG抗体检测方法已被广泛应用[2]。

2.2.4 胶体金免疫层析方法（GICA） GICA是20世纪90年代发展起来的一种检测诊断技术。Cui等应用胶体金标记重组M、N蛋白作为捕获蛋白，建立了胶体金抗体检测技术，显示了较好的特异性和敏感性[3]。Zhou等针对N蛋白的单克隆抗体D5和M蛋白的单克隆抗体E9用胶体金标记，制备了胶体金试纸条，与RT-PCR检测结果相比，特异性、敏感性及检出准确性的符合率达93%以上[4]。胶体金试纸条操作简便、快速，结果判定明显、直观，非常适宜基层现场使用，但该方法在技术上还有待突破。

2.2.5 荧光微珠免疫检测方法（FMIA） FMIA是基于Luminex技术建立的检测方法，目前国外学者研究较多，并被应用到多种病毒的检测诊断中。Langenhorst等将重组Nsp7蛋白和N蛋白共价偶联到Luminex荧光微球上，建立的荧光微珠免疫检测方法可以检测猪唾液和血清中PRRSV抗体，其特异性和敏感性均高于90%[5]。Gerber等应用FMIA与IDEXX公司ELISA试剂盒检测同样的样品，结果显示两个方法的特异性和敏感性无显著差异[6]。FMIA可以检测大量样品和多种抗体，对病毒的混合感染、疫苗免疫效果、野毒株的鉴别诊断及快速诊断方面有重要的应用意义。

2.3 分子生物学技术

2.3.1 RT-PCR检测 在传统RT-PCR的基础上，国内外学者相继建立了多种RT-PCR方法。Liu等建立的3重PCR能够快速鉴别检测CSFV、PCV-2、PRRSV3种猪繁殖与呼吸衰竭病毒，具有较高的灵敏度[7]。郑明等通过反向PCR扩增2对特异性探针标记的报告基因，建立了PRRSV环介导间接PCR检测方法，可对高、低致病性PRRSV进行鉴别诊断[8]。由于该方法特异性高、检测速度快、多种病原同时检测、避免散毒等特点，在PRRS群体的检测上意义重大。

2.3.2 实时荧光定量PCR（real-time PCR） 近几年，实时荧光定量PCR广泛应用于PRRSV的诊断中。Chai等建立了基于SYBR Green的real-time PCR，最低检出量为1 TCID50/0.1 mL[9]。Wernike等成功引入基于异源RNA的内部控制后，建立了多重real-time RT-PCR，可以鉴别诊断美洲型、欧洲型以及高致病性PRRSV[10]。由于实时荧光定量PCR可以实时检测核酸扩增并能自动分析，从而能避免扩增产物污染和不定量的问题。该方法特异性高、敏感性好、操作简单快速，目前成为应用于实验室诊断PRRSV的首选方法之一。

2.3.3 逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）

RT-LAMP原理为核酸链通过在等温环境条件下的循环置换扩增，实现对靶序列的放大。Zhang等建立的RT-LAMP检测方法，样品检测结果与病毒分离结果符合率为100%，与CSFV、PRV、PCV-2、SIV等均无交叉反应[11]。GAO等根据M基因序列设计特异性引物建立了RT-LAMP检测方法，其检测的敏感性高于常规RT-PCR和real-time RTPCR[12]。RT-LAMP方法具有特异性强、敏感性高、无需贵重设备就能满足反应条件、检测快速简便等特点，在PRRSV检测诊断中应用越来越广泛。

2.3.4 原位杂交技术（ISH） 原位杂交技术主要采用地高辛、生物素等标记材料插入PRRSV的基因中制成特异性探针，可用于检测发病猪的肺脏、淋巴结等含有病毒的组织。Han等用ISH方法检测感染欧洲PRRSV的猪组织，结果证明，接种美洲型疫苗的母猪也能感染欧洲型PRRSV，并导致繁殖障碍[13]。原位杂交技术为PRRSV的检测提供了新的途径，但由于成本较高，目前还未大规模应用。

2.3.5 基因芯片技术（Gene chip technology） 该技术主要用于基因序列测定、基因表达谱鉴定、基因突变体的检测分析和基因组的功能研究等方面，是近几年新兴的一项技术，并应用于PRRSV的检测。Xing等利用Affymetrix公司的基因芯片检测样品，与real-time RT-PCR结果一致[14]。基因芯片技术可以进行大规模高通量的检测，虽然目前应用成本较高，但随着研究的逐步深入，该技术将被广泛应用。

3 展望

综上所述，PRRSV检测技术随着PRRS的流行在逐步发展，早期建立的检测方法随着国内外学者的研究不断改进和提高，同时新的检测技术也不断建立和应用。尤其针对PRRSV的高变异和疫苗株的鉴别诊断，为临床的早期预防提供了重要参考。虽然每种检测方法都有其局限性，但相信在以后的研究中会通过优化已有方法和应用新技术，建立全新的检测方法，为预防PRRS的发生和消灭PRRSV提供重要技术支持。

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