微小核糖核酸能否作为急性心肌损伤的未来标志物？

龙浏城综述，向定成审校

微小核糖核酸能否作为急性心肌损伤的未来标志物？

龙浏城*综述，向定成审校

心血管疾病已经成为我国的首要死因，其中急性心肌梗死（AMI）是其主要致死疾病之一。AMI救治的关键是早期诊断，目前公认的最佳血清标志物肌钙蛋白也要在AMI后3.5小时才能检测到，为了进一步提高AMI的生存率和改善预后，我们需要寻求更早的诊断标志物。微小核糖核酸（microRNA）是一种非编码RNA分子，调节细胞的生长、发育、分化及凋亡，在心血管疾病的发生发展中起到重要作用，最近研究也表明其在AMI后血浆中的浓度有显著变化，本文总结了最近的一些与AMI早期诊断有关的microRNA，并对microRNA作为新的AMI早期诊断标志物进行了展望。

急性心肌梗死； 微小核糖核酸；生物学标志物；早期诊断

冠心病现在已经成为了发达国家和发展中国家的主要死因之一。据估计我国每年死于心血管病350万人，占总死亡原因的41%，居各种死因的首位[1]，其中急性心肌梗死（AMI）是心脏病的主要致死疾病之一。 AMI的救治要点是尽早开通梗死相关血管，挽救心肌。AMI的最佳救治时间是在发病后的2～3小时以内，我国ST段抬高的AMI诊断和治疗指南中就指出“时间就是心肌，时间就是生命”，这就更加凸显了早期诊断的重要性。目前用于AMI早期诊断最主要的血清标志物是肌钙蛋白I/T（cTnI/T）[2]，尽管作为目前敏感性和特异性最高的血清标志物，肌钙蛋白也要在AMI后的3.5小时才能检测到升高，不能满足早期诊断的需要。为了进一步提高AMI的生存率和改善预后，我们需要寻求更早的诊断标志物。近年来有越来越多的研究提供了微小核糖核酸（microRNA） 在AMI早期诊断方面的依据。

1 microRNA的生物学特征

microRNA是一类由17～25个核苷酸组成的RNA分子，不能翻译为蛋白质，但是可以在转录后水平负性调节蛋白质的表达（因为其茎环结构可以与mRNA的3’-UTR配对结合，发挥负性调节作用）[3]；microRNA具有较好的保守性，在各物种中同一性较高，广泛的参与了生物学的过程，如细胞的生长发育、分化、增值、凋亡、炎症、损伤修复等；目前已经确定且完成测序的人类microRNA有700多个，据估计人类编码的microRNA有1000多种，大部分存在于蛋白质编码基因中的内含子或者两个基因之间的独立基因片段当中[4]。

血浆和体液中可以检测到的microRNA有100多种，主要是由肝、肺、肾、血细胞来源的。血浆中的microRNA主要以两种形式存在：非囊泡和囊泡形式，其中80%以非囊泡形式存在，与脂质的载体相结合，如Argonaute2蛋白（与microRNA结合后可以形成高度稳定的复合物，甚至在细胞死亡后，还能保持稳定，仍能在血液中检测出来），核仁磷酸蛋白1和高密度脂蛋白[3]。

2 与急性心肌梗死相关的microRNA

心脏中存在的microRNA多达200多种，其中心肌中比较丰富的有：miR-1、miR-133、miR-499等；很多动物实验和临床研究都表明在AMI早期，血浆或体液中的microRNA浓度会发生变化，甚至随着AMI的进展具有动态演变的表现[5-8]。因此，有可能成为未来AMI的新兴标志物。现就研究较多的microRNA进行介绍如下。

2.1 miR-1和miR-133：miR-1和miR-133主要存在于肌组织当中，包括平滑肌、骨骼肌和心肌，其中心肌中含量最高。miR-1有两个亚型miR-1-1和miR-1-2（分别由MIR1-1和MIR1-2基因编码）而miR-133有三个亚型：miR-133a-1，miR-133a-2和miR-133b（分别由MIR133A1、MIR133A2和MIR-133B编码）。miR-133a-1和miR-133a-2有着相同的成熟序列，而miR-133b仅仅表现为3’末端的单个核苷酸的不同。人类基因中，MIR1-1和MIR133A2都位于20号染色体，MIR1-2和MIR133A1位于18号染色体，这两对基因组成双顺反子共同调控和表达[9]。所以miR-1和miR-133在血液中常表现为类似的变化。miR-1主要参与心肌的发生和分化，在新生婴儿心脏中可以测到高表达[10]。miR-133与平滑肌的增生相关，参与了动脉粥样硬化的进程和心肌的纤维化[11]。

在大鼠实验中，行冠状动脉结扎术1小时后，miR-1就显著增高，在6小时后达到顶峰（基础值的200倍）。三天后，又回落到正常基线水平[7,12]。Cheng等[13]选择小鼠尿液作为检测标本，发现AMI 3小时后尿液中miR-1开始升高，并且在24小时达高峰（基础的50倍），在7天后，尿液中miR-1的值回落至正常水平。这显示：miR-1与AMI有着强烈的相关性，并且随病程呈现动态改变，尿液中的检测提示其可能成为一种非侵入性的检测指标。D’Alessandra等[14]发现在小鼠冠状动脉结扎术后15min血浆中miR-1、miR-133a、miR-133b的浓度都明显增高，峰值分别出现在18小

时、6小时、6小时，然后开始下降，出现与肌钙蛋白T相似的动态改变。尽管骨骼肌中也富含miR-1、miR-133a、miR-133b，但在肢体缺血时，并不会引起血中含量的变化，提示miR-1、miR-133a、miR-133b具有一定的心肌特异性；Wang等[15]在大鼠AMI模型中，也发现了miR-1、miR-133a、miR-133b在AMI后的动态变化。Gidlӧf等[16]在缺血再灌注的猪的模型中发现miR-133a在缺血后30min开始增高，在120min后达到峰值。

在临床AMI患者的观察研究中也发现了类似的变化，一项17例AMI患者与33例健康对照的研究中，发现AMI症状出现4小时后miR-1开始上升，并且在8小时后达最高峰（达对照组的15倍），而后开始逐渐下降，这个变化曲线与肌钙蛋白T的变化曲线相吻合[17]。在另一项67例AMI患者与32例健康对照的研究中，同样发现了miR-1、miR-133a的动态变化，受试者特征曲线下面积（AUC）分别为：0.8265（95%可信区间0.7441～0.9088）、0.9468（95%可信区间0.9057～0.9879）[18]。在病例数达159例的研究中与非AMI的患者相比，miR-1的水平也显著增高，到出院时回落到了正常水平，并且miR-1的升高与年龄、性别、是否患有糖尿病无关,其区别AMI和非AMI患者的AUC值为0.774[5]。Liebetrau等[6]利用经皮室间隔化学消融术（TASH）患者作为模拟AMI患者（n=21），观察患者miR-1、miR-133a的动态变化，15min后开始增高，分别达基础值3倍和2.9倍，75min达到最高值，分别达基础值60倍和50倍，也提示随时间呈动态改变。Widera等[19]对444例ACS患者进行观察研究,其中不稳定型心绞痛（UAP）117例，非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）131例，ST段抬高型心肌梗死（STEMI）196例。将UAP作为对照组，发现AMI患者（包括NSTEMI和STEMI）血中miR-1、miR-133a、miR-208a较对照组明显升高且差异具有统计学意义。提示miR-1、miR-133a、miR-133b有作为新的诊断AMI标志物的可能性。 Gidlӧf等[16]发现血中miR-1和miR-133a的水平与肾小球滤过率的相关，提示经肾脏排出，可以通过尿液检查诊断AMI。

2.2 miR-208：miR-208主要有两个亚型：miR-208a和miR-208b。前者是由α-心肌肌球蛋白重链基因（Myh6）的内含子编码的，而miR-208b是由α-心肌肌球蛋白重链基因（Myh7）的内含子编码，miR-208a参与心肌增生、传导等功能的调节[20]。 Ji等[21]通过对359种microRNA的阵列分析，发现miR-208a具有高度的心脏特异性。然而 Adachi等[22]通过对人体各组织的miR阵列分析却发现miR-208a和miR-208b在人体心脏中特异性不及miR-499。

Ji等[21]在用异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌损伤的实验中，观察到了miR-208增高，提示miR-208可反映心肌的损伤。在AMI小鼠的研究中发现，对照组（假手术组）小鼠的血中几乎检测不到miR-208a，而实验组在行冠状动脉结扎术30min后可以在血浆中检测到miR-208a，3小时后达峰值[14]。Wang等[15]也发现了在大鼠AMI后miR-208a的动态演变，AMI前不能检测到miR-208a的值，AMI后1小时达可以检测的水平，3小时达峰值，6～12小时逐渐下降，24小时后又降到不能检测的水平。

健康人血中的miR-208a为阴性，而在AMI患者血中miR-208a的阳性率可达90.9%[15]。在对25例STEMI患者的观察研究中，发现在心肌梗死症状出现12小时后miR-208b值达对照组的3 000倍，ROC曲线下面积达到了1.0，对STEMI诊断具有很好的敏感性和特异性[16]。在不稳定型心绞痛和AMI患者的鉴别中，miR-208a具有较好的诊断价值[19]。然而，Li等[23]在对117例AMI、182例心绞痛患者和100例健康人的研究中发现AMI患者血中miR-208值显著高于正常对照，但却低于心绞痛患者。

2.3 miR-499：miR-499也是心肌特异的microRNA，并且参与了心肌肥厚、重构等进程的调节[24,25]，健康个体中基本检测不到。对小鼠冠状动脉结扎模拟AMI, AMI后4小时和24小时miR-499分别增高到103倍和95倍[8]。Wang等[15]在AMI小鼠模型和AMI患者血液中也检测到了类似的变化。在一项较大样本量的研究中，AMI发生后，AMI患者（n=510）miR-499浓度比对照组（健康个体n=87）迅速增高了5倍以上，其中STEMI（n=397）比NSTEMI（n=113）增高明显（P＜0.001）。胸痛症状出现3小时以内，miR-499阳性率为93%，AUC值为0.97[26]。在胸痛鉴别方面，研究表明miR-499在AMI患者显著升高，而在不稳定型心绞痛、慢性心力衰竭和正常对比人群中都没有显著变化，并且与肌酸激酶MB同工酶（CK-MB）变化曲线呈正相关[22]。Corsten等[27]对比了AMI患者（n=32）和不典型胸痛患者（无冠状动脉狭窄，n=36）的血miR-499浓度，AMI患者miR-499显著高于对照组，达基础值的100倍。

2.4 其他microRNA：miR-328是一种广泛存在于人体各组织的microRNA，通过对转录后的调控参与了很多疾病进展，如阿尔茨海默症、乳腺癌的耐药、胶质瘤的恶性进展等；miR-328在AMI患者（n=57）比健康对照组有着显著变化，但在血浆和全血中变化程度不一样（10.9倍和16.1倍）[28]。Meder等[29]通过对AMI患者（n=20）全血进行全基因组筛选，发现了121种在AMI后发生变化的microRNA,并确定了miR-1291和miR-663b的对鉴别AMI有着最佳的特异性和敏感性。通过对AMI患者（n=17）血浆miR-126的时间动态分析（AMI症状出现后4h、8h、12h、24h、72h、1w），发现AMI后血浆miR-126浓度呈下降趋势，整体曲线与肌钙蛋白T下降曲线近似[17]。在AMI患者（n=18）的小样本研究中，miR-30和miR-195在AMI后都显著升高，8小时后达峰值，let-7b则表现为下降，但也是在8小时达峰值，而后曲线呈下降趋势，联合三者计算AUC，症状后8小时和12小时分别为0.93、0.92[30]。

Li等[23]利用6种microRNA（miR-1，miR-134，miR-186，miR-208，miR-223和miR-499）组成一个联合分析系统，发现其在胸痛鉴别AMI诊断方面AUC值为0.830（95%CI，0.751～0.910）显著高于cTnT的AUC,0.768（95%CI，0.672～0.864）和CK-MB的AUC，0.709（95%CI，0.606-0.812）；Meder等[29]利用全基因测序方法也进行了类似的研究，利用20种microRNA组成的检验芯片对20例AMI患者和20例对照进行检测，这种联合检验芯片对AMI的鉴别敏感度达到90%，特异性达到96%，准确性达到93%，AUC达到了0.99。

3 小结

理想的标志物应该满足以下几个要求：①可以通过非

侵入方式获得所需标本；②对疾病的诊断具有高度的特异性和敏感性；③有助于早期诊断； ④能较敏感地反映疾病的动态变化情况；⑤在取样后的标本中稳定性好，标记物的半衰期足够长；⑥具有快速、准确诊断的检查手段[31]；⑦检测手段经济、方便。就目前的研究看，microRNA具备了其中的一些优点：他们具有一定的组织特异性，可以稳定的存在于血液中；可以通过序列特异性扩增（PCR）大大提高检测的敏感性。这些优点使得microRNA成为了新一代心脏疾病尤其是AMI快速诊断的“热门侯选”。大量的研究证据也表明，AMI后miR-1、miR-133、miR-499等都随时间和疾病进展有动态演变过程，但是与高敏性肌钙蛋白相比，并未表现出明显优势[19,26]。

因此，尽管microRNA作为AMI早期诊断标志物的前途是光明的，但是仍然缺少大样本的研究证据，尤其是以心绞痛、肺栓塞、动脉夹层、心包炎等为对照的研究证据；另一方面，microRNA的检测方法还有待向快速、稳定、高效、经济等方向发展。故其近期应用于临床尚有困难，但这也正是未来要努力研究的方向。

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2014-05-18)

（编辑：汪碧蓉）

510010 广东省广州市，中国人民解放军广州军区广州总医院 心内科

龙浏城 硕士研究生 主要研究方向为急性心肌梗死的早期诊断标志物 Email：jone_llc@163.com*中国人民解放军第二军医大学在读研究生

向定成 Email：dcxiang@foxmail.com

R54

A

1000-3614（2015）01-0084-03

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.01.023