猪圆环病毒分子生物学诊断技术及基因工程疫苗的研究进展

李天芝，于新友，沈志强，2

(1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

猪圆环病毒分子生物学诊断技术及基因工程疫苗的研究进展

李天芝1，于新友1，沈志强1，2

(1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

文章论述了猪圆环病毒分子生物学诊断方法，包括常规PCR 方法、套式PCR方法、多重PCR方法、PCRRFLP方法、荧光定量PCR方法、环介导等温扩增技术等，并就其基因工程疫苗方面的研究进行了着重阐述。

猪圆环病毒；分子生物学诊断；基因工程疫苗

猪圆环病毒(PCV)是圆环病毒科、动物圆环病毒属的成员。PCV可以分为PCV1和PCV2两种血清型。PCV1无致病性。PCV2具有致病性，该病主要以进行性消瘦和多系统病理损伤为特征，可引起断奶猪和育肥猪生长缓慢、呼吸急迫、消瘦、贫血、出现黄疸现象，剖检后发现有淋巴结肿大、肝硬变、多灶性黏液性气管炎、间质性肺炎和肾炎，给养猪业造相当严重的经济损失。1991年，在加拿大首次暴发该病，随后，世界各国家和地区都有该病的报道，并在患断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎和肾病综合征(PDNS)等病猪体内分离到PCV2，并证明PCV2与这些严重威胁着养猪业的疾病密切相关。目前该病毒引起了国内外兽医界的广泛关注。

1 分子生物学诊断

1.1 常规PCR 方法

PCR方法是根据目的片段设计引物，借助仪器和DNA聚合酶体外大量扩增部分或全部目的片段，是一种快速、简便、特异的诊断方法。蒋成砚等根据GenBank中PCV2的序列设计1对特异性引物，用PCR方法扩增猪PCV2基因保守区序列，并对PCR扩增程序进行优化，结果表明：该法具有快速、敏感、特异等优点，可用于PCV2的检测和流行病学调查等，178份临床病料中有83份阳性样品，阳性率为46.6%。李英等采用针对PCV2 ORF2设计的特异性引物对某猪场出现的PMWS典型症状的病猪进行PCR检测，从病猪的组织样品中检测PCV2，从10头发病猪的组织样品中检测PCV2，结果有7头呈阳性结果。

1.2 套式PCR方法

套式PCR方法是设计内外2种引物，同时扩增2次，该法能节省模板，且敏感性较高。王贵平等根据GenBank登录PCV2基因全序列，设计2对引物，建立了PCV2的套式PCR检测方法，对该方法用序列分析、酶切等方法进行了鉴定，同时用该套式PCR方法对华南地区287个猪场的1 560份样品进行了检测，结果，983份为PCV2阳性，阳性率为63%。赵浩军等根据Genbank中发表的PCV2全基因序列，设计2对PCV2特异性引物，建立套式PCR检测方法。外测引物p1、p2扩增片段长度为647 bp，内测引物p3、p4扩增长度为219 bp。其中用外部引物可扩增DNA含量到10-5mg/mL，并且套式PCR比普通PCR灵敏性还要提高103倍。

1.3 多重PCR方法

多重PCR是一种特殊的PCR技术，它在同一PCR体系中，加入多对引物，同时检测2种或2种以上的病毒DNA，它具有快速、灵敏度高、高效、特异性强等优点而广泛用于临床的快速诊断。王隆柏等建立猪群常见CSFV、PRRSV、PRV、PCV2和PPV的5种疾病的的多重PCR诊断方法，该法特异性好，对SIV、JEV、SS2、PEDV核酸的检测结果为阴性，能检测到的CSFV、PRRSV、PRV、PCV2和PPV核酸浓度分别为220、1.6、72、400和370pg。付朋飞等根据PBoV PCV2基因序列，设计2对引物，通过对扩增条件进行优化，建立了能够同时检测PBoV和PCV2的双重PCR方法。该方法可以同时扩增出PBoV的209bp和PCV2的476bp特异性片段，而对伪PRV、PPV、沙门氏菌、大肠埃希氏菌DNA模板扩增结果均为阴性，对PBoV和PCV2的最低检出量均为100拷贝/µL。单重PCR与双重PCR检测符合率为100%。

1.4 PCR-RFLP方法

PCR-RFLP方法通过设计保守引物，PCR扩增目的基因序列片段，然后用限制性内切酶酶切，通过观察其酶切片段差异即可鉴定不同种或不同基因型。Fenaux等先以PCR快速而有效地扩增微量的猪圆环病毒DNA，然后再利用RFLP区分PCV1和PCV2，以此来进行猪圆环病毒的检测和定型，他们根据PCV1和PCV2的243 bp片段，利用仅在PCV2上有的限制性酶切片段位点NcoI来鉴定PCV1和PCV2。PCV2的PCR产物可被NcoI切成168bp和750 bp的两个片段，而在PCV1的PCR产物上则无NcoI的位点，所以不能被NcoI切割，这样就可以直接区分PCV1和PCV2了。王新等用PCR-RFLP方法，对PK-15细胞，IBRS-2细胞以及疑似PMWS、猪皮炎与肾病综合征的病变组织进行了PCV2检测以及血清型的鉴定，结果显示，IBRS-2细胞和1份PMWS病变组织中检测出PCV1基因片段，1份PMWS病变组织和1份PDNS病变组织检测出PCV2基因片段。

1.5 荧光定量PCR方法

荧光定量PCR技术是指采用SYBR GreenⅠ荧光染料或荧光探针通过连续监测荧光信号强弱的变化来测定特异性产物的量，不需要分离PCR产物，即能准确定量起始模板数。董林等建立了检测PCV2的特异性荧光定量PCR方法，该法Ct值与标准品模板在3.21×100～4.16×108拷贝/µL范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.9988，斜率为-3.286。该方法与PCV1、PRV、PRRSV、PPV、CSFV、大肠杆菌基因组均无交叉反应，敏感性为3.21×100拷贝/µL，比常规PCR高1 000倍，批间和皮内重复试验变异系数均小于3.00%。对临床采集PCV2疑似阳性病料检测结果表明，所建立的荧光定量PCR阳性检测率为58.94%，显著高于普通PCR检测率。李鹏等根据PCV2 ORF1设计1对特异性引物，建立了SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法，该法灵敏度可达10-100拷贝/µL，比常规PCR检测方法灵敏度高10倍，而与PRRSV、PRV、CSFV、和PPV没有交叉反应，与常规PCR相比，该法具有较高的灵敏度和特异性。

1.6 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术(LAMP)是在等温条件进行扩增反应。基因的扩增和产物的检测可一步完成，扩增效率和特异性高，可在15～60 min扩增109～1010倍，可只通过扩增产物的有、无来判别。申世川等建立了基于ORF2基因的PCV2 LAMP检测方法，在BstDNA聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增。所建立方法在61 ℃反应1 h能够成功的检测出PCV2基因组DNA，结果可经电泳检测及肉眼观察；敏感性和特异性试验表明，检测敏感度可以达到0.5 pg的DNA分子，所建立LAMP方法的阳性检出率与国标PCR的阳性检出率符合度为100%。杨泽晓等建立了快速检测PCV2的LAMP方法，在64 ℃45 min条件下可扩增出大于1 345 bp的特异性梯状DNA条带，检测限度可达10 copies/µL，用它对PCV1、PPV、PRV、PRRSV和CSFV的核酸进行扩增，但结果均为阴性。

2 基因工程疫苗

2.1 亚单位疫苗

只含有病原微生物的抗菌抗原成分，而不含有核酸，但能刺激机体产生特应性免疫应答的一类疫苗，称为亚单位疫苗。付玉洁等为评价猪圆环病毒(PCV)2a/2b两种基因型病毒株及其重组Cap蛋白(rCap)之间的交互免疫，采用重组杆状病毒表达的2种Cap蛋白(PCV2a-rCap和PCV2b-rCap)亚单位疫苗。免疫小鼠后进行攻毒，结果，以PCV2a和PCV2b各为指示病毒对病毒抗血清和rCap蛋白抗血清进行交叉中和试验，同型病毒株与同型血清的中和抗体效价均高于异型病毒株。病理观察显示，免疫鼠均未见明显病理变化，攻毒对照鼠肺脏出现一定程度的病理损伤。刘丹等以重组杆状病毒表达的重组PCV2-Cap蛋白制备亚单位疫苗，免疫BALB/c鼠测定其抗体、中和抗体。结果表明，该蛋白亚单位疫苗能够提供良好的免疫保护效果，能够有效诱导小鼠产生明显的体液免疫应答。

2.2 核酸疫苗

构建含有外源抗原基因的重组质粒，免疫动物后，表达的特异性抗原蛋白通过与MHC-Ⅰ类或MHC-Ⅱ类抗原分子结合，刺激机体产生特异性免疫应答，该类疫苗称为核酸疫苗，又名DNA疫苗。史小红等将重组真核表达质粒pcDNAORF1-ORF2免疫小鼠，2周后加强免疫，同时设置pcDNA-ORF1、pcDNAORF2、pcDNA3.1-(+)、PCV2全毒疫苗和PBS对照。结果表明，该重组质粒诱导产生PCV2抗体水平与其他试验组相比差异显著。闫若潜等将猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2/猪白介素-2(PoIL-2)嵌合重组表达质粒(rpcDNA3.1/PCV2-1inker-PoIL-2)免疫10日龄健康仔猪，结果发现重组质粒对猪体的免疫和免疫保护效果显著。

2.3 活载体疫苗

采用弱毒或无毒病原微生物作为表达载体，对其导入外源抗原基因，制成疫苗后，接种动物，诱导机休产生特异性免疫应答反应，这类新型疫苗称为活载体疫苗。宫婷等构建了表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒，对重组腺病毒的分子生物学鉴定和在小鼠上的初步免疫试验结果表明，重组腺病毒可介导Cap蛋白在真核细胞中的表达，并且表达的靶蛋白具有较好的免疫原性，为进一步将其开发成新型PCV2疫苗奠定了基础。王子龙等利用NDV LaSota弱毒疫苗株为活病毒载体，通过反向遗传操作系统构建出表达PCV2Cap的重组病毒(rLa-PCV2/ Cap)，以及表达删除核定位信号(NLS)的Cap(CapΔ41)的重组病毒(rLa-PCV2/CapΔ41)，并对外源蛋白的表达效果进行了检测，为研究新型PCV2疫苗奠定基础。钞安军等将PCV2ORF2基因插入到PRV通用载体pG中，成功构建了重组病毒PGO，并用该重组病毒免疫6周龄雄性小鼠并检测分析了PGO的免疫原性，结果表明，该重组病毒能有效抵抗PCV2强毒攻击。

3 前景展望

随着分子生物学的不断发展，目前已经建立了PCV2多种分子生物学检测方法，这些检测方法各有利弊，如常规PCR方法具有特异性强、敏感性高、检出率高等特点，但不能准确的定量、容易污染，且敏感性有限。荧光定量PCR仪器和探针的合成价格昂贵，检测成本比较高，LAMP方法灵敏度高导致假阳性。最好几种检测方法结合起来，综合判断，才能使检测结果更加准确可靠。近年来，PCV2新型疫苗研制，已经取得了很大的进展，但由于种种原因近停留在实验室阶段，并没有大规模推广应用实际生产中，相信在不久的将来着病毒分子生物学的发展及对猪圆环病毒蛋白功能本质研究的深入，必将研制出安全、高效、廉价、易于保存和运输的新型基因工程疫苗。

略。

2015-06-13）

山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目(SDAIT-06-011-14)，山东省自然科学基金项目(ZR2013CQ006)

李天芝(1985-)，女，汉族，山东菏泽人，助理研究员，硕士，主要从事动物传染病研究。