肝星状细胞在逆转肝纤维化中的作用

徐天华，陈金铃，朱丹丹，吕 蕾，段义农

肝星状细胞在逆转肝纤维化中的作用

徐天华，陈金铃，朱丹丹，吕 蕾，段义农

肝纤维化是一种能够导致门静脉高压、肝硬化、肝衰竭的严重疾病。已经发现肝星状细胞的活化是引起肝纤维化的中心环节，因此抑制肝星状细胞的活化、加速肝星状细胞的清除有望逆转肝纤维化。本文将对活化的肝星状细胞的凋亡、衰老以及清除的研究进展作综述，阐明肝星状细胞在肝纤维化过程中所起的作用及相关机制。

肝纤维化逆转；肝星状细胞；凋亡；衰老

肝脏受到各种致病因子侵袭后会引起肝损害和炎症反应，机体会对慢性肝损伤进行修复。若这种修复过程过度或失控就会引起肝内细胞外基质过度沉积，导致肝脏结构、肝功能发生异常，最终形成肝纤维化。肝纤维化是最严重的肝脏疾病之一，可由肝炎病毒、过量饮酒、非酒精性脂肪肝炎所诱导，最终导致门静脉高压、肝硬化、肝衰竭以及增加患肝癌的机率[1]。因此，对于寻找逆转肝纤维化的途径非常必要。

1 肝纤维化与肝星状细胞

纤维化过程中，间叶样成纤维细胞会迁移到伤口区域合成基质蛋白，导致细胞外基质过度增生、异常沉积。肝纤维化中的间叶样细胞即肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)，是肝纤维化过程中主要的效应细胞和细胞外基质的主要来源。HSCs，又称伊东细胞或贮脂细胞，位于Disse间隙内，紧贴着肝细胞和肝窦内皮细胞。HSCs可通过自身突触与相邻近的肝细胞、肝窦内皮细胞及神经末梢细胞相互接触。正常情况下HSCs是静止的，它形态较小且胞内含有脂质颗粒。在肝窦状间隙微环境中，HSCs能够生成多种细胞外基质，介导细胞间的接触，并在促进血管生成、调控氧化应激反应方面发挥着重要的作用[2-3]。

但当肝脏受到一系列的慢性损伤，静止的HSCs会被激活，活化的HSCs变得大而扁平，失去了储存脂质颗粒的能力，能合成大量的细胞外基质、分泌许多促炎症、促纤维化的细胞因子。同时活化的HSCs会转化成肌成纤维样细胞，增强细胞分泌胶原的能力并促使更多的细胞迁移到坏死、炎症区域[4]。HSCs促进肝纤维化不仅由于细胞数量的增加，而且增加了细胞外基质的产生。细胞外基质的沉积损伤了肝细胞、破坏了它们的结构与代谢功能，加剧了肝纤维化，最终会导致肝衰竭、肝硬化等疾病[1]。

2 肝星状细胞的活化

HSCs的活化是指静止的HSCs转变为肌成纤维细胞(myofibroblast，MFB)的过程。在肝脏微环境中，多种因素参与了HSCs的活化，这些因素包括理化因素、多种细胞因子、调节性蛋白及细胞外基质等。

乙型肝炎病毒、原发性硬化性胆管炎、酒精滥用及药物代谢过程中的毒性产物超标等均可以造成肝细胞的损伤，损伤的肝细胞会释放启动肝星状细胞活化的生长因子，激活静止的肝星状细胞转化形成MFB，分泌大量的细胞外基质，最终导致纤维化[1]。

多种细胞因子在HSCs活化的各阶段发挥着重要的作用。肝细胞损伤产生的转化生长因子-α(TGF-α)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、内皮素-1(ET-1)等细胞因子在炎症前期可以促发HSCs活化；在炎症期，库普弗细胞被激活,释放TGF-β1、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)进一步的激活HSCs，促进细胞增殖及转化为MFB；炎症后期MFB自分泌TGF、血小板源生长因子(PDGF)等细胞因子使活化得以持续,甚至去除启动因素(肝细胞损伤)后纤维化进程仍持续[1-2,5]。

PPARs(peroxisome proliferator-activated receptors)是新近发现的能够调节HSCs活化的重要的蛋白分子，在维持肝脏的稳态过程中发挥着关键的作用。它有三种亚型：α，β和γ，HSCs仅表达γ亚型。PPAR-γ对于调控HSCs活化起着重要的作用。体外培养的HSCs，通过诱导PPAR-γ蛋白或mRNA的表达，从而抑制HSCs增殖，有助于维持HSCs的静止状态。但当PPAR-γ表达下调或失活时则会导致HSCs的活化和肝纤维化的发生[6-7]。

细胞外基质具有多重的生物学特性，除了具有保护、抗压、连接等物理学作用以外，也参与细胞的活化过程。细胞外基质的过度沉积一方面会损伤肝细胞，释放启动肝星状细胞活化的生长因子；另一方面会激动HSCs细胞膜上的受体，例如整合素(integrin)，在integrin α β/FAK(局部黏着斑激酶，focal adnesion kinase)信号通路被激活后可通过整合、拆卸黏着斑促使HSCs的活化[1]。同时由于HSCs的激活又会合成大量的细胞外基质，从而进一步活化HSCs。

3 肝纤维化具有可逆性

肝纤维化的发生与发展受多种调控机制的影响[1]。自Katz等(1966)在曼氏血吸虫病患者中发现肝纤维化逆转现象后，人们改变了过去肝纤维化“不可逆转”的观点。许多学者通过大量的啮齿目动物研究证实，肝脏发生纤维化病变后，纤维性的细胞外基质发生重构，肝脏中接近于正常肝结构的组织重新再生。同时，大量临床数据也支持肝纤维化发生逆转的可能[8-9]。肝纤维化的逆转主要通过阻断由端肽介导的胶原与胶原之间的相互作用[10]，抑制上皮细胞通过上皮-间质转化途径转变为MFB[11]，刺激NK细胞杀伤毒性[12]等途径，从而抑制HSCs的活化、增殖，增加活化HSCs的清除及胶原纤维的降解等，最终减轻肝纤维化。其中减少活化的HSCs数量及抑制其活性是实现肝纤维化逆转的重要途径。它通过诱导活化HSCs衰老[13]、促进活化的HSCs凋亡[14]以及增强免疫细胞对活化的HSCs清除[15]而实现。

4 HSCs细胞衰老与肝纤维化

细胞衰老是指细胞增殖出现不可逆的停滞。当细胞发生衰老时，细胞能维持活力代谢活动，但对于有丝分裂原的刺激则处于增殖失能状态[16]。与细胞衰老相关的调控途径主要有p16-pRb途径，p53-p21-pRb两条途径，其中p53 和pRb 基因是两条调控途径的核心，在诱导与维持细胞衰老中起着关键作用[17-18]。在肺纤维化及肾纤维化研究中，细胞衰老一定程度上抑制了纤维化的发生及发展[19]。Krizhanovsky等在研究肝纤维化时发现，表达细胞衰老重要标志物细胞衰老相关β-半乳糖苷酶 ( senescence-associated β-galactosidase，SA-β-GAL) 的区域，肝纤维化重要标志物α-SMA 的表达则降低，ECM 沉积明显减少。在细胞衰老相关基因p53 及INK4a/ARF分别敲除的肝纤维化小鼠模型中，肝脏纤维化明显加重。当p53及INK4a/ARF同时敲除后，HSCs丧失衰老的能力，结果导致α-SMA表达上调，肝脏纤维化面积显著增加。而在特异性干扰肝脏HSCs p53表达的转基因小鼠纤维化模型中，HSCs的p53表达受到抑制，HSCs增殖活性(Ki67+α-SMA+)增强，从而导致肝纤维化明显加重[10]。在CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型中， Xiaoni Kong[20]等人发现IL-22通过活化STAT3-SOCS3-p53信号通路可诱导HSCs的衰老，活化HSCs的衰老最终限制了小鼠的肝纤维化。这些结果提示衰老的HSCs能限制肝纤维化进程，有望实现肝纤维化的逆转[21]。

此外，衰老 HSCs能激活参与免疫监视基因的表达。一方面能减少纤维化相关蛋白的分泌，同时也能降解已存在的纤维化相关蛋白；另一方面能增强机体免疫清除功能，从而减少活化的HSCs数量[22-23]。活化的HSCs衰老后，HSCs表面配体分子ULBP2表达增加，通过与NK细胞表面受体NKG2D相结合，激活NK细胞的免疫清除功能，加速衰老HSCs的清除，最终能够逆转肝纤维化[15,24]。

5 HSCs的凋亡与肝纤维化

细胞凋亡通常是指细胞自主有序的死亡，是自体损伤现象。纤维化肝脏中沉积的大量细胞外基质源于活化的HSCs。通过诱导HSCs凋亡，可减少活化HSCs的数量以及降低肝脏中胶原和组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)的表达量，从而逆转肝纤维化[14]。因此，除了HSCs衰老以外，促进HSCs凋亡成为另一个有效地逆转肝纤维化的方法。

HSCs凋亡主要是由线粒体途径、死亡受体途径和内质网途径所介导，并最终由caspase酶家族执行凋亡过程[25]。另外，其它一些信号通路被发现也能调节HSCs的凋亡。肿瘤坏死因子诱导凋亡相关配体受体-2 (TRAIL-R2)在肝细胞中不表达，却在活化的HSCs中特异性表达增加。这使得HSCs更容易发生TRAIL所介导的凋亡，拮抗TRAIL-R2的抗体能够选择性的诱导HSCs的凋亡，抑制肝纤维化的过程[26]。此外， 活化NF-kB信号通路能够抑制肿瘤坏死因子(TNF-α)所诱导的活化HSCs的凋亡；相反，抑制NF-kB相关信号通路，会增加HSCs凋亡的比率，产生潜在的抗纤维化作用[27]。有研究发现：四甲基吡嗪能够通过诱导p53活化，促进HSCs的凋亡，从而逆转肝纤维化[28]。此外，我们之前的研究也证明p53在调节HSCs凋亡中发挥着重要的作用, 日本血吸虫可溶性虫卵抗原(soluble egg antigens, SEA)能够通过增加p53的表达诱导HSCs的凋亡从而逆转肝纤维化[29]。

6 HSCs免疫清除与肝纤维化

肝脏微环境中，多种免疫细胞参与了活化HSCs的清除，实现了肝纤维化的逆转，这些细胞包括自然杀伤细胞(NK)、库普弗细胞(KC)、T淋巴细胞和自然杀伤T细胞(NKT)。

肝纤维化过程中NK细胞具有特异性的保护作用，它能够选择性杀死活化的HSCs，对于早期活化的HSCs或衰老的HSCs尤为敏感。体外共培养NK细胞和HSCs， NK细胞可直接作用于HSCs，导致HSCs发生凋亡的数目增加。之前有研究者发现，使用聚肌胞甘酸(Poly(I:C))或IFN-γ能够增加NK细胞活化受体NKG2D的表达，而NKG2D可以与HSCs上配体分子ULBP2结合，从而激活 NK细胞的免疫清除功能，增强NK细胞对活化HSCs的细胞毒性[30]。STAT1(信号传导与转录活化因子1)在NK细胞对活化的HSCs清除过程中发挥着关键作用。在STAT1敲除的小鼠模型中，NK细胞对HSCs杀伤作用显著减弱。这可能是由于STAT1的敲除，下调了NK细胞中NKG2D的表达，从而影响了NK细胞的免疫清除功能[31]。

KC细胞是一类存在于肝窦状隙的巨噬细胞，正常情况下具有非特异性杀伤作用。然而在肝纤维化形成过程中，它能够诱导活化HSCs凋亡以及细胞外基质的降解[32]。KCs细胞通过激活caspase级联反应和分泌相关诱导凋亡的肿瘤坏死因子来促进HSCs的凋亡、抑制HSCs的增殖[33]。此外，KCs细胞还能有效地抑制HSCs内组织金属蛋白酶抑制剂的表达，通过分泌炎症抑制因子IFN-γ、IL-10促使细胞外基质的降解，最终导致活化HSCs数量的减少，从而逆转肝纤维化[34-35]。

在乙型肝炎和丙型肝炎病人体内，CD4+/CD8+的比率会明显减少且肝脏纤维化形成的速度会加快[36]。由此，人们提出T淋巴细胞可能参与调节肝脏纤维化的过程。CD4+T细胞能够分化成不同类型的辅助性T细胞, 调节不同的免疫反应。Th1细胞分泌的IFN-γ能够限制HSCs的活化、增殖，诱导细胞凋亡[37]。另外，调节性T细胞(CD4+CD25+T cells)能够限制NK细胞的活化，减弱NK细胞对HSCs的清除作用[38]。

NKT细胞是个独特的T细胞异质群体，IL-30可以上调它的活化受体NKG2D的表达，而NKG2D可以与HSCs上配体分子Rae1结合，激活NKT细胞的免疫清除功能[38]，直接杀死活化的HSCs，发挥抗纤维化的作用。

7 结 语

肝纤维化严重地威胁着人类的健康，因此研究逆转肝纤维化的分子机制显得尤为重要。HSCs的活化是导致肝纤维化的中心环节。抑制HSCs活性、加速HSCs的清除有望逆转肝纤维化。诱导活化的HSCs发生衰老、凋亡能够限制促纤维化细胞因子及胶原的分泌；同时，多种免疫细胞参与活化HSCs的清除，从而减少活化HSCs的数量。因此，探讨诱导活化的HSCs发生衰老、凋亡及加速活化的HSCs清除的分子机制，对于寻找逆转肝纤维化的潜在靶点具有重要意义。

[1]Friedman SL. Mechanisms of hepatic fibrogenesis[J]. Gastroenterology, 2008, 134(6): 1655-1669.

[2]Tacke F, Weiskirchen R. Update on hepatic stellate cells: pathogenic role in liver fibrosis and novel isolation techniques[J]. Expert Rev Gastroenterol Hepatol, 2012, 6(1): 67-80.

[3]Duval F, Moreno-Cuevas JE, Gonzalez-Garza MT, et al. Liver fibrosis and mechanisms of the protective action of medicinal plants targeting inflammation and the immune response[J]. Int J Inflam, 2015, 2015: 943497.

[4]Otogawa K, Ogawa T, Shiga R, et al. Induction of tropomyosin during hepatic stellate cell activation and the progression of liver fibrosis[J]. Hepatol Int, 2009, 3(2): 378-383.

[5]Gressner AM. Transdifferentiation of hepatic stellate cells (Ito cells) to myofibroblasts: a key event in hepatic fibrogenesis[J]. Kidney international, 1996, 54: S39-45.

[6]Zhang X, Han X, Yin L, et al. Potent effects of dioscin against liver fibrosis[J]. Sci Rep, 2015, 5: 9713.

[7]Duan Y, Gu X, Zhu D, et al.Schistosomajaponicumsoluble egg antigens induce apoptosis and inhibit activation of hepatic stellate cells: a possible molecular mechanism[J]. Int J Parasitol, 2014, 44(3/4): 217-224.

[8]Ellis EL, Mann DA. Clinical evidence for the regression of liver fibrosis[J]. J Hepatol, 2012, 56(5): 1171-1180.

[9]Ramachandran P, Iredale JP, Fallowfield JA. Resolution of liver fibrosis: basic mechanisms and clinical relevance[J]. Semin Liver Dis, 2015, 35(2): 119-131.

[10]Chung HJ, Steplewski A, Chung KY, et al. Collagen fibril formation. A new target to limit fibrosis[J]. J Biol Chem, 2008, 283(38): 25879-25886.

[11]Dai W, Zhao J, Tang N, et al. MicroRNA-155 attenuates activation of hepatic stellate cell by simultaneously preventing EMT process and ERK1 signalling pathway[J]. Liver Int, 2015, 35(4): 1234-1243.

[12]Gur C, Doron S, Kfir-Erenfeld S, et al. NKp46-mediated killing of human and mouse hepatic stellate cells attenuates liver fibrosis[J]. Gut, 2012, 61(6): 885-893.

[13]Krizhanovsky V, Yon M, Dickins RA, et al. Senescence of activated stellate cells limits liver fibrosis[J]. Cell, 2008, 134(4): 657-667.

[14]Zhang X, Han X, Yin L, et al. Potent effects of dioscin against liver fibrosis[J]. Sci Rep, 2015, 5: 9713.

[15]Gao B, Radaeva S. Natural killer and natural killer T cells in liver fibrosis[J]. Biochim Biophys Acta, 2013, 1832(7): 1061-1069.

[16]Campisi J, d’Adda di Fagagna F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007, 8(9): 729-740.

[17]Chen J, Huang X, Halicka D, et al. Contribution of p16INK4a and p21CIP1 pathways to induction of premature senescence of human endothelial cells: permissive role of p53[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2006, 290(4): H1575-1586.

[18]Bennecke M, Kriegl L, Bajbouj M, et al. Ink4a/Arf and oncogene-induced senescence prevent tumor progression during alternative colorectal tumorigenesis[J]. Cancer Cell, 2010, 18(2): 135-146.

[19]Clements ME, Chaber CJ, Ledbetter SR, et al. Increased cellular senescence and vascular rarefaction exacerbate theprogression of kidney fibrosis in aged mice following transient ischemic injury[J]. PLoS One, 2013, 8(8): e70464.

[20]Kong X, Feng D, Wang H, et al. Interleukin-22 induces hepatic stellate cell senescence and restricts liver fibrosis in mice[J]. Hepatology, 2012, 56(3): 1150-1159.

[21]Jun JI, Lau LF. Cellular senescence controls fibrosis in wound healing[J]. Aging (Albany NY), 2010, 2(9): 627-631.

[22]Sagiv A, Biran A, Yon M, et al. Granule exocytosis mediates immune surveillance of senescent cells[J]. Oncogene, 2013, 32(15): 1971-1977.

[23]Mehal W, Imaeda A. Cell death and fibrogenesis[J]. Semin Liver Dis, 2010, 30(3): 226-231.

[24]Risques RA, Lai LA, Himmetoglu C, et al. Ulcerative colitis-associated colorectal cancer arises in a field of short telomeres, senescence, and inflammation[J]. Cancer Res, 2011, 71(5): 1669-1679.

[25]Johnson A, DiPietro LA. Apoptosis and angiogenesis: an evolving mechanism for fibrosis[J]. Faseb J, 2013, 27(10): 3893-3901.

[26]Zhang F, Lu Y, Zheng S. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma cross-regulation of signaling events implicated in liver fibrogenesis[J]. Cell Signal, 2012, 24(3): 596-605.

[27]Ping J, Gao AM, Qin HQ, et al. Indole-3-carbinol enhances the resolution of rat liver fibrosis and stimulates hepatic stellate cell apoptosis by blocking the inhibitor of kappaB kinase alpha/inhibitor of kappaB-alpha/nuclear factor-kappaB pathway[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2011, 339(2): 694-703.

[28]Zhang F, Kong DS, Zhang ZL, et al. Tetramethylpyrazine induces G0/G1 cell cycle arrest and stimulates mitochondrial-mediated and caspase-dependent apoptosis through modulating ERK/p53 signaling in hepatic stellate cellsinvitro[J]. Apoptosis, 2013, 18(2): 135-149.

[29]Wang J, Xu F, Zhu D, et al.Schistosomajaponicumsoluble egg antigens facilitate hepatic stellate cell apoptosis by downregulating Akt expression and upregulating p53 and DR5 expression[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2014, 8(8): e3106.

[30]Glassner A, Eisenhardt M, Kramer B, et al. NK cells from HCV-infected patients effectively induce apoptosis of activated primary human hepatic stellate cells in a TRAIL-, FasL- and NKG2D-dependent manner[J]. Lab Invest, 2012, 92(7): 967-977.

[31]Jeong WI, Park O, Radaeva S, et al. STAT1 inhibits liver fibrosis in mice by inhibiting stellate cell proliferation and stimulating NK cell cytotoxicity[J]. Hepatology, 2006, 44(6): 1441-1451.

[32]Liu C, Tao Q, Sun M, et al. Kupffer cells are associated with apoptosis, inflammation and fibrotic effects in hepatic fibrosis in rats[J]. Lab Invest, 2010, 90(12): 1805-1816.

[33]Tang X, Yang J, Li J. Accelerative effect of leflunomide on recovery from hepatic fibrosis involves TRAIL-mediated hepatic stellate cell apoptosis[J]. Life Sci, 2009, 84(15/16): 552-557.

[34]Bansal R, Post E, Proost JH, et al. PEGylation improves pharmacokinetic profile, liver uptake and efficacy of interferon gamma in liver fibrosis[J]. J Ctrl Release, 2011, 154(3): 233-240.

[35]Hung KS, Lee TH, Chou WY, et al. Interleukin-10 gene therapy reverses thioacetamide-induced liver fibrosis in mice[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 336(1): 324-331.

[36]Krishnadas DK, Li W, Kumar R, et al.Invitroactivation and differentiation of naive CD4+and CD8+T cells into HCV core- and NS3-specific armed effector cells: a new role for CD4+T cells[J]. Cell Immunol, 2009, 259(2): 141-149.

[37]Langhans B, Alwan AW, Kramer B, et al. Regulatory CD4+T cells modulate the interaction between NK cells and hepatic stellate cells by acting on either cell type[J]. J Hepatol, 2015, 62(2): 398-404.

[38]Mitra A, Satelli A, Yan J, et al. IL-30 (IL27p28) attenuates liver fibrosis through inducing NKG2D-rae1 interaction between NKT and activated hepatic stellate cells in mice[J]. Hepatology, 2014, 60(6): 2027-2039.

Effect of hepatic stellate cells in liver fibrosis regression

XU Tian-hua,CHEN Jin-ling,ZHU Dan-dan,LU Lei,DUAN Yi-nong

(DepartmentofPathogenBiology,SchoolofMedicine,NantongUniversity,Nantong226001,China)

Liver fibrosis is considered as a serious disease, which can lead to portal hypertension, liver cirrhosis and liver failure. It has been well established that the activation of hepatic stellate cells plays a vital role in the hepatic fibrosis. Inhibiting hepatic stellate cells activation and accelerating clearance of hepatic stellate cells are promising strategies against liver fibrosis. In this assay, apoptosis, senescence and the clearance of the activated hepatic stellate cells will be reviewed, which aims to demonstrate the effect of hepatic stellate cells and its mechanism in hepatic fibrosis regression.

liver fibrosis regression; hepatic stellate cells; apoptosis; senescence

s: Chen Jin-ling, Email: chenchennt@126.com; Duan Yi-nong, Email: yinongduan@aliyun.com

国家自然科学基金项目(No.81471975, 81171589, 81401683)，江苏省自然科学基金项目(No.BK20140435)，江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)以及南通大学研究生科技创新计划项目(No.YKC15054)联合资助

陈金铃,Email:chenchennt@126.com; 段义农,Email:yinongduan@aliyun.com

南通大学医学院病原生物学系，南通 226001

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.11.017

R372

A

1002-2694(2015)11-1065-04

2015-07-12；

2015-08-21

Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81471975, 81171589, 81401683), the Jiangsu Provincial Natural Science Foundation (No. BK20140435), the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) and the Graduate Student Research and Innovation Program of Nantong University (No. YKC15054)