分子生物学技术在猪瘟野毒与兔化弱毒鉴别诊断方法中的研究进展

于新友，李天芝，苗立中，唐 娜，沈志强，

(1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

分子生物学技术在猪瘟野毒与兔化弱毒鉴别诊断方法中的研究进展

于新友1，李天芝1，苗立中2，唐 娜2，沈志强1，2

(1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

综述了分子生物学技术在猪瘟野毒与兔化弱毒鉴别诊断的4种方法（RT-PCR方法、荧光定量RT-PCR方法、RT-PCR与RFLP相结合方法、环介导等温扩增方法）的研究进展，对猪瘟的净化和防控有一定的参考价值。

分子生物学技术；猪瘟野毒；兔化弱毒；鉴别诊断

猪瘟(CSF)是黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒(CSFV)引起的一种猪急性、热性、高度接触性传染病，在世界范围内广泛流行，其发病率和死亡率均高，对养猪业危害十分严重。世界动物卫生组织(OIE)在《国际动物卫生法典》中将其列为法定传染病之一。疫苗接种是防控猪瘟的重要手段，我国研制的猪瘟兔化弱毒在世界上广泛应用，对猪瘟的防控起到了重要的作用，但猪瘟弱毒疫苗株（HCLV）能在已接种的猪体内持续存在一段时间，这给CSFV野毒感染猪和HCLV接种猪的鉴别诊断带来较大困难，再加上近年来，我国猪瘟的流行和发病特点发生了很大变化，出现了所谓 “非典型猪瘟”、“温和型猪瘟”和“带毒母猪综合征”，在病理剖检上也常常不同于典型猪瘟的病理变化，也给临床诊断带来了很大困难[1]。因此，准确区分猪瘟野毒株与兔化弱毒疫苗株的敏感、特异的鉴别诊断方法非常重要。笔者就鉴别猪瘟野毒株与兔化弱毒疫苗株的方法进行了综述，以期对猪瘟病毒感染早期进行准确诊断，淘汰强毒感染猪，减少未感染的免疫猪被误杀，为猪瘟的净化和防控提供参考。

1  RT-PCR 方法

RT-PCR是以病毒的RNA为模板进行反转录，再以PCR进行核酸扩增来检测病毒的方法，以其简便、迅速、灵敏等优点在动物疾病诊断上得到了广泛的应用。Li Y等[2]建立了能区分猪瘟强、弱毒的复合套式RTPCR诊断方法，该方法从HCLV和石门株强毒株基因组分别扩增出447和343 bp的特异性片段，从2种病毒基因组混合物中同时扩增出447和343 bp的特异性片段，该方法对BVDV、JEV、TGEV、PEDV、PRV、PCV2、PRRSV、PPV以及正常细胞基因组进行检测时均为阴性，可以检测出0.04 pg的CSFV RNA，用该方法检测133份临床样品，结果有42份为强毒感染，18份为弱毒疫苗。胡建和等[3]根据GenBank中猪瘟病毒及近源病毒的基因组全序列，选择特异保守区域设计了2对猪瘟病毒引物，建立了一种敏感性、特异性强、重复性好的鉴别猪瘟强毒和HCLV的多重RT-PCR鉴别诊断方法。该法从HCLV和石门强毒株的基因组中分别扩增出1条大小为492和178 bp的特异性片段，从强弱毒株混合物中1次扩增出2条大小为492和178 bp的特异性片段，对伪狂犬病病毒的扩增结果为阴性，能检测出0.8 pg的猪瘟病毒RNA，应用试验表明，8份疑似猪瘟病料中5份为强毒感染，2份为弱毒感染，1份为弱毒和强毒的混合感染。郭抗抗等根据GenBank中36株猪瘟病毒强毒株和HCLV株的基因序列，分别设计了针对CSFV强毒和HCLV株的特异性引物，建立了一种能区分CSFV强毒和HCLV的RTPCR检测方法。该法可从CSFV强毒株和HCLV株中分别扩增出大小为187和492 bp的特异性片段，对PRRSV、PCV2和TGEV等检测结果均为阴性，对10份疑似猪瘟临床样品进行检测后发现，有2份疑似CSFV强毒、7份疑似疫苗弱毒。李安等对GenBank中登录的25株CSFV强毒株和HCLV株基因组全序列进行比较分析，设计1对猪瘟病毒强毒株和HCLV检测通用引物，扩增片段为609 bp，并在该对引物扩增区域内设计针对疫苗弱毒的特异引物，扩增片段为237 bp，该法对牛病毒性腹泻病毒和其他猪源病毒均不发生非特异反应，成功建立了一种能够区分猪瘟病毒强毒和HCLV的敏感、特异、重复性好的RT-nPCR鉴别诊断方法。陈本龙等[4]根据Genbank上发表的猪瘟病毒全基因组序列，选择猪瘟强毒株和兔化弱毒株疫苗株序列存在的差异区域，分别设计合成2条强毒株和HCLV株的特异性上游引物，同时选择高保守区域序列，设计合成了一条强毒和兔化弱毒共用的下游引物，成功建立了一种能够区分猪瘟病毒强毒株和HCLV的RT-PCR检测方法。该法从猪瘟强毒株和兔化弱毒株中扩增出了大小分别为680 bp和785 bp的特异性片段，对PRRSV、BVDV、PRV、PCV2等病毒基因组扩增均为阴性，可检测出最低为0.5 pg的猪瘟病毒RNA，具有高度的特异性和敏感性。

2  荧光定量RT-PCR方法

实时荧光定量PCR是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术，它融汇了传统PCR技术灵敏、快速、特异的特点以及光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，为猪瘟病毒的定量检测提供了新的分子生物学诊断技术。H.S.Cho等应用不同荧光基团标记的2条TaqMan MGB探针建立了能鉴别韩国CSFV野毒株和弱毒疫苗株的荧光RT-PCR方法，但此方法没有做到定量检测，而且也无法对我国的猪瘟病毒野毒株和HCLV株进行鉴别检测。J.J.Zhao等根据GenBank中的猪瘟病毒强毒和弱毒株基因组序列，设计了1对针对猪瘟病毒的通用引物和2条分别针对猪瘟病毒强毒和HCLV的特异性TaqMan探针，建立了能区分猪瘟病毒强毒和HCLV株的复合实时荧光定量RT-PCR检测方法。该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒株与HCLV完全区分开来，而不与其他猪源病毒发生非特异反应。Lihong Liu等建立了疫苗株特异性和野毒株特异性的实时荧光RTPCR方法，其特异性强、敏感性高和重复性好。Leifer等建立了CSFV野毒株和HCLV的荧光定量RT-PCR鉴别诊断方法，该法对猪瘟弱毒疫苗株具有良好的扩增效果，而对猪瘟野毒和其他瘟病毒均无扩增产物，具有良好的特异性与敏感性。刘俊等[5]针对CSFV野毒株和HCLV株的基因组特点设计了一条特异性探针，建立了猪瘟野毒株一步TaqMan-MGB RT-PCR诊断方法，该法能检测5.3×102pgCSFV病毒核酸；能检测除HCLV以外的猪瘟流行野毒株，对牛病毒性腹泻病毒、细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒等项检测均为阴性；对122份疑似猪瘟样本检测的结果与RT-nPCR方法的符合率为94.3%（115/122），阳性和阴性符合率分别为86.4%（38/44）和98.7%（77/78）。谢金文等通过对GenBank中登录的25株CSFV强毒株和HCLV株全基因组序列进行比较分析，设计一对共用下游引物以及分别针对CSFV强毒株与弱毒疫苗的特异性上游引物，建立的能鉴别CSFV强毒感染与弱毒疫苗的荧光定量RT-PCR方法，其Tm值分别为（84.5±0.5）℃和（88.5±0.5）℃，该法特异性强，对其他相关病毒无特异性扩增；敏感性高，最低检出量为5×RID50的细胞疫苗基因组拷贝；重复性好；并且扩增效率高、线性范围广、检测时间短，可对免疫猪群中CSFV强毒感染做出快速准确的鉴别检测，为有效防制猪瘟提供依据。余以刚等设计了1对通用引物和2条特异性MGB探针，建立了猪瘟病毒野生株和疫苗株荧光RT-PCR鉴别方法，该法在选定的猪病相关病毒组内特异性符合率达100%；对野毒株和HCLV的检测灵敏度分别达到1TCID50/mL和0.1TCID50/mL；组内和组间变异系数均在0.7%～2.2%之间。用该法对猪肉、脾脏和血液病料进行猪瘟野毒检测的阳性率分别为66.7%、60.0%、77.8%，而传统方法的阳性率分别为52.4%、40.0%、50.0%；检出率比传统方法要高。

3  RT-PCR与RFLP方法结合

限制性片段长度多态性分析(RFLP)是先将靶基因相关片段用PCR扩增，然后利用限制性内切酶能够特异性地识别特定的碱基序列对扩增产物进行酶切，通过电泳可将酶切片段分离检测，具有分辨率高、重复性好等优点，但操作比较复杂，对实验条件要求高。赵耘等[6]建立了套式RT-PCR与RFLP相结合区分猪瘟强毒、疫苗弱毒的鉴别诊断RT-PCR/RFLP方法。该法对猪瘟病毒石门株与HCVL均能扩增出约为250 bp的特异性片段，而BVDV、BDV均未扩增出。RT-PCR纯化产物被HgaI酶切后，弱毒能够被酶切成大小分别约为150 bp、120 bp的2条片段，而强毒则不能被切开，可应用于CSFV野毒株和疫苗株的鉴别检测。S.Vilcek等将CSFV基因组5′端非编码区的选择部分进行扩增，然后用选择性限制内切酶Bbr PI对扩增的DNA片段进行切割，结果供试的13株CSFV疫苗株中的11株可被Bbr PI切割，切割位点在5′端非编码区引物324/326旁的区域(CACGTG)，这11株疫苗株被切割电泳后均一致地出现2条特征性带，分别长195 bp和89 bp，而23个欧洲田间野毒在5′端非编码区无Bbr PI酶切位点，不能被此内切酶切割。董浩等[7]根据GenBank上已发表的HCV E2基因高度保守区设计一对特异性引物，从Shimen株和疫苗株中均能扩增出一条大小为750 bp的特异性片段，Shimen株的RT-PCR产物则被BglⅡ酶切为大小分别为520和230 bp的2条带，疫苗株的RT-PCR产物不能被BglⅡ酶切，对病毒RNA的最小检出量为3.96×10-4μg/m L，用该法可对猪瘟强毒株与HCLV株进行鉴别。胡继明等建立了猪瘟病毒野毒株和HCLV的RT-PCR-RFLP鉴别检测方法，对野毒株和HCLV进行RT-PCR扩增片段均能为825 bp片段，野毒株的PCR产物能被ApaⅠ酶切为322 bp和503 bp的2个片段，HCLV株则不能被酶切，检测出RNA的最低浓度为2.86×10-2μg/m L。

4  环介导等温扩增技术

环介导等温扩增(LAMP)方法是日本学者Notomi等在2000年发明的一项恒温核酸扩增新技术，具有操作简便、快速、高效、敏感、特异、经济等特点，特别适合在现场和基层部门应用。X.J.Zhang等建立了可视化检测猪瘟病毒野毒株的LAMP方法，该法可检测出2.5TCID50的CSFV石门株基因组RNA。对HCVL株、BVDV、PRRSV、TGEV、PEDV、PRV、PPV、PCV2检测结果均为阴性。通过对126份不同样品进行检测比较，该方法与实时荧光定量RT-PCR检测方法的符合率达100%。随后，又建立了检测HCLV的LAMP方法，对CSFV 强毒株、BVDV、TGEV、PEDV、PRRSV、PPV、PRV、PCV2检测结果均为阴性。张改平等[8]比较分析了CSFV标准强毒株、疫苗株、不同基因亚型的野毒株的全基因组序列差异，设计一套分别针对猪瘟强毒与弱毒NS5B基因的LAMP引物，建立特异性的猪瘟强毒株与疫苗株的LAMP检测方法。该方法特异性好，比RT-PCR灵敏度高出1 000倍，且重复性稳定性良好，为快速准确地鉴别CSFV野毒感染和疫苗接种提供了有效的方法。

5  小结与展望

近年来，猪瘟流行情况复杂，无规律可寻，猪瘟防控任务仍十分艰巨，由于猪瘟弱毒疫苗在我国的大规模应用，猪瘟的强毒、疫苗弱毒鉴别诊断成为猪瘟预防与控制中非常困难和棘手的问题。虽然猪瘟野毒与兔化弱毒分子生物学鉴别诊断方法有很多，但各有利弊，常规RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、检出率高等特点，但不能准确地定量，容易污染，且敏感性有限，很难对处于亚临床感染状态的病猪进行早期诊断。荧光定量 RT-PCR技术弥补了常规RT-PCR方法的缺点，但由于需要价格昂贵的仪器与试剂，限制了其在基层兽医部门的广泛应用。LAMP方法检测快速、简便，适合在基层兽医和养殖场进行推广使用，对指导猪瘟的防控具有重要的意义，但LAMP方法灵敏度高易导致假阳性。随着分子生物学的发展，相信一些新型诊断方法终将问世并得以推广应用，使人们能够快速、准确地鉴别诊断猪瘟野毒与兔化弱毒，从而尽早对猪瘟暴发做出准确快速的诊断，防止疫情蔓延；可以将CSFV野毒感染猪迅速从免疫猪群中筛查出来并予以清除，降低了在疫病暴发时弱毒疫苗免疫猪被淘汰的概率，为猪瘟的净化和防控提供有效的方法。

[1] 丘惠深.净化是有效控制我国猪瘟的重要手段[J].猪业科学，2010，27(3)：119.

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[4] 陈本龙，张立怀，王建华，等.鉴别猪瘟病毒强毒和疫苗弱毒的RT-PCR检测方法的建立[J].中国动物检疫，2013，30（11）：71-74

[5] 刘俊，王琴，范学政，等.猪瘟病毒野毒株TaqMan-MGB荧光定量PCR鉴别方法的建立与应用[J].中国农业科学，2009，42(12)：4366-4371.

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[7] 董浩，李菲，王鑫，等.猪瘟病毒野毒株与疫苗株酶切检测方法的建立、优化及应用[J].中国畜牧兽医，2011，38（9）：187-189

[7] 张改平，何文博，王德国，等.猪瘟强毒株与兔化弱毒疫苗株的LAMP鉴别检测[J].郑州大学学报：理学版，2014，46（3）：85-90.

2014-11-12）

山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目(SDAIT-06-011-14)

于新友(1983-)，男，汉族，山东菏泽人，助理研究员，硕士，主要从事动物传染病诊断技术研究。