PCR技术及其在禽流感诊断中的应用

2015-01-24胡贞

中国畜牧兽医文摘 2015年8期

关键词：禽流感特异性引物

胡贞

(广东省龙川县动物疫病预防控制中心,广东龙川 517300)

PCR技术及其在禽流感诊断中的应用

胡贞

(广东省龙川县动物疫病预防控制中心,广东龙川 517300)

目的:分析PCR技术原理并探讨其在禽流感诊断中的应用价值。方法:回顾分析近几年PCR（多聚酶链式反应）技术在禽病中的应用研究资料，并对该技术的特点进行总结。结果:PCR技术具有比较好的灵敏性、特异性等优点，操作十分迅速便利。既可单独运用于实验、检测中，还可同其他技术相配合，其应用对象比较广泛，几乎覆盖了所有生物，在DNA检测和RNA扩增检测中同样适用。结论:PCR技术在禽流感诊断中具有较高的应用价值，对禽流感病毒检测十分灵敏准确，可在实际诊断过程中予以利用和推广。

PCR技术禽流感诊断应用

PCR（多聚酶链式反应）技术是美国Getus在1985年发明的一种基于DNA变性与复性原理，高效扩增体外特定DNA片段的技术。该项技术的主要特征是敏感性和特异性均高于传统的免疫学方法，操作较为简便，同时又快速高效，在生物学基因鉴定、实验、检测等方面可以均加以利用[1]。此外，该技术还可应用在临床样品检验中，成为临床诊断的重要参考依据之一。本文在分析PCR技术原理的基础上，重点研究了其发展概况和临床应用现状。

1 PCR技术基本原理

PCR（多聚酶链式反应）是通过体外酶的合成作用，形成具有特异性DNA片段的一种新技术，发展于20世纪80年代，属于体外核酸扩增新技术。该技术基本原理分别涉及3个基础反应程序，即变性程序、退火程序和延伸程序，3个程序经多次循环交替作用，逐渐将DNA片段扩增到几百万倍，使得大量“半保留复制链”进一步增多，新链又作为下一次的循环模板得以延续。在95℃高温下，靶DNA双链经受热变性程序后裂解成为两条单链模板，而后在37～55℃条件下，两条寡后核苷酸引物同与其互补的单链模板相结合，构成部分双链，其次在DNA聚合酶72℃最适温度下，将引物分端作为合成起点，4种DNTP作为合成原料，从模板5′向3′延伸，实现DNA新链的合成[2]。理论分析表明，反应程序每循环一次时长大致为2～4min，大概2～3h就可以把基因扩大百万倍，整个反应过程在几个小时内就可完成，经反复循环后目的基因大约能够扩增亿倍。此后可以运用序列分析或探针杂交手段来检测分析基因的扩增产物。

大量科学实验及研究表明，PCR技术具有比较好的灵敏性、特异性等优点，其扩增模板的理论值可达到一个分子，目前有学者Crescenzit等证明了PCR技术在癌症染色体转位检测过程中的灵敏度大约可达到 10-5～10-6；而PCR在扩增过程中只针对同引物序列相互补的模板，因此该项技术的特异性较优。

2 PCR技术发展概况

作为一种应用范围广的多元检测技术，PCR技术一直受到学者的重视，随着该技术的深入研究，传统的PCR技术得到不断改进，并呈现出不断发展变化的特点。现将主要的PCR技术延伸类型阐述如下。

2.1 反转录PCR技术

反转录PCR（即RT-PCR）属于DNA体外扩增技术的一种，在检测丰度低的特异性RNA方面有着较高价值。该项反应包括两个步骤，即单引物介导与反转录酶催化共同发挥作用合成RNA互补链，在加热条件下RNA互补链同RNA链解离后同另外一引物退火，聚合酶催化引物经延伸形成双链靶 DNA，最后回归到传统的PCR进行靶DNA扩增。一般理论下，该项新型PCR技术能够检测到总RNA里低丰度小于1ng的mRNA，在取得并扩增特定RNA相互补的RNA互补链方面有着重要作用。

2.2 反向PCR技术

反向PCR是用于扩增已知序列两侧未知数列的体外扩增技术，通过限制性内切酶来消化已知序列，并结合T4DNA连接酶作用环化存在黏性末端的未知序列，在上述线状到环化及再线状变化情况下，原来两侧的未知序列会置于已知数列中央，由此PCR扩增技术可以对未知数列进行测定。该种方法对于研究转位因子、基因游走以及已知序列DNA两侧病毒的整合点位研究具有重要意义。

2.3 半套式PCR

在半套式PCR技术第2次基础反应中，2个引物和第1次基础反应里的1个引物是完全相同的，通过内外2对引物的先后2次扩增，能够在微量模板里获取更高浓度及纯度的DNA目的片段，其敏感性较之常规的反转录PCR技术更优，在临床样品、病毒感染检测中价值突出。

2.4 二温式PCR

二温式PCR其变性温度、退火温度及延伸温度只存在2种温度变化，较之传统的PCR技术，其操作环节更为简洁，实现了较快的扩增速度，为临床样品检测节约了时间。与多重PCR技术相结合，形成了二温多重PCR技术，该项技术综合了两种技术的优势，一方面将PCR反应扩增时的退火温度与延伸温度进行合并，成为同一个温度；另一方面使得同一检测体系能够检测出多种病原，是一种简单高效的PCR扩展技术。

3 PCR技术在禽流感诊断中的实际应用

禽流感是多发于禽类中的一种病毒性传染病，主要由正黏病毒科A型流感病毒（即AIV）所引起，现已被WTO和OIE列为A类重大传染疾病，目前该疾病在世界范围内均有分布，给家禽业发展造成了极大的影响。

针对禽流感病毒（即AIV），传统的检测方法需要进行较长周期的分离鉴定试验，还需进行野外取材，其他病毒混入的概率大大增加，其诊断结果往往不够准确，甚至出现误诊情况。反转录PCR技术主要从基因水平的角度进行AIV检测，其诊断将H亚型相同N亚型不同的HA基因保守序列作为靶序列，通过特异性引物和AIV病毒RNA、反转录多聚酶链式反应、凝胶电泳提取，预期条带回收及测序，最终进行定性判断。该种方法的敏感性、特异性较好，克服了传统检测方法的缺点，应用在早期的禽流感诊断中，具有便捷、使用、敏锐等优势。

套式反转录PCR技术（即巢式反转录PCR技术）是在设计2对引物后，进行不同程度的片段扩张。其中1对引物进行稍长的片段扩增，在此扩增范围内设计另1对引物，将先设计的第1对引物产物作为最后所扩增产物的模板。目前有研究人员参照了基因库中典型禽流感病毒的基因序列设计了两对引物，构建了适用于快速检测AIV的套式反转录PCR检测方法，分别对不同血清类型的禽类进行实验，实验中的禽类均可扩增出具有特异性的阳性实验结果，其检测的敏感程度较高。

荧光PCR技术在基础PCR技术的优势上汇聚了DNA杂交特异性及敏感性、光谱技术精准定量等优势，实现了PCR技术与光谱、计算机技术的全面有机融合。该项技术能够实时检测PCR基础反应中每个循环产物的荧光信号，随基础反应的推进而实现反应产物累计，荧光信号的强度呈现等比例增加的特点，可作为起始模板定量、定性分析的重要依据[3]。目前有研究者建立了荧光PCR法对AIV H5进行检测，得出敏感性达到了10-7。另有实际应用研究表明通用型的荧光PCR技术可检测AIV 的多种亚型，在引物检测过程中还检出其他常见禽类病毒，同时不存在交叉反应。