卵黄抗体在国内外医药方面的研究现状

王新颖，周鹤峰，邵 敏

卵黄抗体在国内外医药方面的研究现状

王新颖，周鹤峰，邵 敏

本文阐述卵黄抗体的优势性质和结构特点，概述卵黄抗体在抗人兽共患病、诊断应用、抗蛇毒类生物制品和抗生育制品等方面的研制与应用。

卵黄抗体；优势性质；人畜共患病；生物制品

抗体在疾病的诊断、免疫防治和其它基础研究中一直发挥着重要的作用，人工制备方式是大量获取抗体的有效途径。根据过去的研究发现，传统的多克隆抗体有一些无法避免的缺点，比如：不易大量生产，特异性不高，易发生交叉反应，违反动物福利相关政策等，从而应用受限。目前研究的单克隆抗体可以克服特异性不高的缺点，但是由于不能发生沉淀和凝集反应，并且制备繁杂，价格较高，因此其应用范围也不大，高成本的投入限制了通过哺乳动物生产大规模的抗体。卵黄抗体(Egg yolk Immunoglobulin，IgY)是指利用免疫禽类的方式，从其生产的蛋的卵黄中提取相应的特异性抗体。卵黄抗体具有许多独特的优势，比如：制备成本低、产量高、可制成经济型口服免疫球蛋白、对实验动物的伤害性降低，实验过程中蛋黄的易收获性等优点。

目前，IgY被认为是一种可靠的具有经济效益的抗生素替代品，用于对抗多种病原体,如细菌、病毒和寄生虫[1]。IgY具有不与人类补体以及类风湿因子结合等免疫学特性，现在己被广泛用于免疫学诊断和医药等许多方面[2]。本文从IgY抗人畜共患病、诊断应用、抗蛇毒类生物制品和抗生育方面对IgY的研究现状进行了综述。

1 卵黄抗体的优势性质

IgY具有化学性质稳定、对于动物福利政策的提倡、制备成本低、产量高、可制作口服免疫球蛋白、制备提取纯化过程简单、纯度较高、相对于哺乳动物抗体交叉反应少和实验动物来源广泛等优点[1-3]。血清抗体在母鸡体内形成过程中，由于其具有继续合成和转移能力，浓度可以保持平衡稳定[4]。IgY的另外一个突出的优点是所谓的进化距离，由于发育的进化距离导致哺乳动物和鸡存在抗体特异性的差异。鸡产生的抗体相比于系统发育高度保守的哺乳动物产生的抗体在对抗蛋白质和肽方面往往更有效[5]。

与兔IgG的比较可以看出[6]，抗体的采集方式，兔IgG的采集方式对动物有伤害性而卵黄抗体IgY可以降低对动物的伤害；兔IgG的平均产量是每毫升血液可以提取5 mg免疫球蛋白，每月平均可以获得200 mg免疫球蛋白，而IgY的产量为平均每个蛋50-100 mg，平均每月1000-2800 mg；兔IgG在pH 3-10,70℃条件下性状稳定，IgY在pH 4-9,65 ℃下性状稳定；兔IgG的胃蛋白酶稳定性强于IgY，但是兔IgG的胰蛋白酶稳定性弱于IgY[4，6]。IgY等电点(pI)的范围在5.7-7.6，而哺乳多克隆抗体等电点范围为6.1-8.5之间[7]。

2 卵黄抗体IgY的结构

前人认为IgY是一种和哺乳动物抗体IgG类似的免疫球蛋白，目前研究发现IgY是哺乳动物IgG、IgE和IgA的进化祖先[7-8]。X射线晶体衍射结构分析表明，目前发现的免疫球蛋白都是由四肽链分子组成，由两条重链和两条轻链组成，它们的重链的分子量大约50-70 kDa，有450-550个氨基酸，轻链的分子量大约为25 kDa，有214个氨基酸残基[4]。尽管IgY功能和哺乳动物IgG是等效的，但在结构方面却有一定差异，哺乳动物IgG轻链包含一个可变区和一个恒定区，重链包含一个可变区和三个恒定区，卵黄抗体IgY轻链包含有一个可变区一个恒定区，重链则拥有一个可变区和四个恒定区[8]。IgY的分子量是180 kDa，哺乳动物IgG的分子量为150 kDa，IgY的重链分子量是(67-70) kDa，哺乳动物IgG的重链分子量是50 kDa的重链分子量[7]。与哺乳动物的IgG相比，IgY抗体的铰链区的灵活性、摆动性和柔韧性较差，同时也导致了Fab部分的柔韧性也相应降低，IgY相比于IgG是一个更具疏水性的分子[6]- [8]。

IgY的结构特异性源自于其分子结构，在鸡中，抗体IgY 的多样性主要是通过基因转换来实现，从大量的假基因转移至表达位点，通过V-J灵活性的连接而成，以保证多样性，所以基因转换导致了鸡抗体的多样性[9]。

3 卵黄抗体IgY在医药领域的应用

3.1 人畜共患病预防和治疗方面

Jenn-Fa Liou等研究表明[10]，通过使用灭活的人肠病毒71型(EV71)作为抗原肌肉注射白来航鸡进行免疫，该实验目的是对IgY的被动防护进行评估，通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定IgY的抗体活性和特异性。肠病毒71型特异性卵黄抗体应用于感染肠病毒71型的模型小鼠，结果表明，肠病毒71型特异性IgY无论是腹腔注射或口服给药都能显著减少感染肠病毒71型小鼠发病率和死亡率。

爆发性非细菌性急性胃肠炎90%以上是由诺如病毒( NoVs )感染所致，目前市面上没有可用的疫苗或抗病毒药物用来预防和治疗由NoVs所导致的疾病。Ying-Chun Dai等研究表明[11]，IgY通过被动免疫接种诺如病毒NoVs后产生大规模抗 NoVs抗体，50 ug NoVs病毒P颗粒抗原肌肉注射20周龄健康的白来航鸡三次，两个星期作为时间间隔，从首次免疫至第三次免疫后卵黄中的特异性IgY持续增加。通过中和试验表明，特异性IgY可以实现对抗由NoVs病毒感染疾病的预防和治疗。

流感是最为常见的急性病毒性疾病，并且会造成不同程度的全身性疾病，比如：轻度疲劳、呼吸衰竭和死亡。Junlin Wen等研究表明[12]，通过使用灭活后的B型流感病毒(IBV)免疫母鸡，用聚乙二醇6000提取分离卵黄中的IgY，通过ELISA测定IgY的抗体滴度，从第二周开始滴度慢慢增加到第五周到达峰值。通过特异性IgY抗流感病毒感染的动物模型，结果表明，感染B型流感病毒的模型小鼠肺部的病毒滴度显著下降。

弧菌被确认为人类病原体，其中有8种副溶血性弧菌是通过海鲜传染疾病造成严重的肠道疾病，Kassima等[13]研究探讨IgY对抗海鲜传播疾病中的2种弧菌病原体的抑制效果。肌肉注射免疫接种在四个不同位点，IgY抗体滴度在第四周达到峰值。结果表明，IgY对副溶血性弧菌和创伤弧菌有显著抑制作用无论在液体介质中还是在被弧菌感染的小鼠模型中，特异性IgY在体外和体内发挥着重要的抗菌作用，IgY可以用于研制针对弧菌的抗生素或口服免疫治疗剂。

厌氧细菌牙龈卟啉菌是牙周炎的主要致病菌主要通过与一些口腔细菌形成牙菌斑造成牙周疾病。Susumu Hamajima等研究表明[14]，通过使用克隆的40 kDa的外膜蛋白(是牙龈的重要聚集因子)作为抗原肌肉注射免疫母鸡，从蛋黄中得到高度纯化的IgY，结果表明，纯化的IgY抗体可特异性识别40 kDa的外膜蛋白，纯化后的IgY可显著抑制戈登链球菌，可用于被动免疫接种，并且可有效对抗牙龈感染的牙周疾病。

齐静姣等研究表明[15]，旋毛虫病(trichinellosis)是一种严重的人兽共患寄生虫病，用可溶性旋毛虫肌幼虫抗原与福氏完全佐剂充分乳化后皮下注射免疫育龄种鸡，于鸡双翅及背部皮下多点注射，再经水稀释法初步纯化浓缩后获得高效价的特异性IgY，通过免疫鸡可成功诱导出高效价的抗旋毛虫抗体，为旋毛虫病感染的防治和治疗探索了新的方法和途径。JJ Xu等研究表明[16]，通过口服5种艾美耳球虫活卵囊免疫母鸡六次，用ELISA测定血清和卵黄抗体效价，结果表明IgY的平均产量为9.2mg/ml，新孵出的雏鸡可表达艾美耳球虫特异性IgY抗体，该抗体可以预防鸡球虫病。

3.2 诊断应用方面 近年来卵黄抗体被成功地应用于免疫检测和诊断。赵文思等研究表明[17]，将纯化后的HIV-1 p15(gag)蛋白与完全弗氏佐剂作为抗原等体积混匀均匀并乳化后免疫母鸡，用水稀释法进行提取特异性IgY，通过ELISA等技术检测抗体的特异性，结果获得了具有较高纯度的特异性IgY，特异性IgY能够与HIV-1蛋白P15特异性结合，在HIV-l gag的诊断检测方面提供了新的思路，为研制抗HIV-lpl5卵黄抗体IgY的大量生产奠定了实验基础。

艰难梭菌相关性腹泻(CDAD)已经成为医院内腹泻的主要原因，艰难梭菌的毒素A蛋白是 CDAD的主要致病因素。郭桂萍等研究表明[18]，纯化合成艰难梭菌毒素A重组质粒，将目的蛋白作为抗原与弗氏佐剂按照1∶1体积比混合，采取胸肌和颈部皮下多点注射，剂量为1 ml,免疫4次，时间间隔为2周。结果显示，制备出针对艰难梭菌毒素A的C端结构域的卵黄抗体，卵黄抗体经纯化后纯度约90%，可用于艰难梭菌相关性腹泻的诊断和治疗，为利用IgY进行艰难梭菌相关性腹泻CDAD的诊断和治疗打下了基础。

3.3 抗蛇毒类生物制品方面 临床上使用的抗蛇毒血清是通过免疫马而制得相应抗体，但是使用的抗毒素马血清效价不高、相对分子质量大、价格昂贵等缺点。相比于每公斤马平均生产10 ml血清，使用IgY抗蛇毒血清用于治疗家养动物是最便宜的替代品。研究表明[19]，用20 mg的非洲蛇毒液肌肉注射免疫母鸡，在鸡乳房区域采用两个或三个不同位点进行注射，以3周作为时间间隔，以免疫前的鸡蛋作为阴性对照，应用水稀释法进行提取，结果表明，第一次免疫后抗非洲蛇毒IgY抗体滴度显著增加，在第9周达到最高峰，具有较高的抗蛇毒血清酶活性， IgY抗蛇毒血清的疗效好，安全性高。

3.4 抗生育制品方面 精子具有免疫原性，相应的特异性抗体与精子抗原特异性结合后可通过抑制精子的运动能力等原因而导致不孕，使人们能够用精子制成抗原去免疫机体，使其产生相应的抗体，从而研制并开发避孕药的潜在的可能性。研究报道，用人全精子抗原来免疫产蛋母鸡[20]，从卵黄中获得了大量特异性的抗人精子IgY，结果发现这些抗精子IgY可以使精子凝集，使抗精子IgY有可能成为未来极有潜力的候选避孕药具。

赵万乐等研究表明[21]，用处理后的奶牛Y精子与完全佐剂1∶1混合后作为抗原在母鸡胸肌上采用不同的5点进行肌肉注射，采用水稀释法提取抗体，进行凝集试验和测定抗体含量、得率和效价，结果显示，卵黄中含 有与奶牛Y精子作用的有效抗体IgY，并且能使精子发生凝集现象，但是IgY对其作用的专一性还有待研究。

4 结 语

综上所述，IgY具有制备成本低、产量高、可实现大批量规模生产，可制成经济型口服免疫球蛋白，且对实验动物的伤害性可降到最低。随着卵黄抗体的发展，应用于疾病的防治、检测和治疗方面也越来越广泛，并且IgY也正在向保健品和功能性食品等方面发展。但是目前IgY在国内的研究应用还处于初步阶段，主要的原因是：对于IgY没有统一的质量标准作为参考；没有出台统一的质量监控标准；实验用动物没有标准化只是市面的商业用家禽。

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Research status of yolk antibody in medicine application in Chinese and foreign studies

WANG Xin-ying,ZHOU He-feng,SHAO Min

(DepartmentofBioengineering,ZhuhaiCampus,ZunyiMedicalCollege,Zhuhai519041,China)

In this paper, we systematically describe the advantages of the nature and structural characteristics of yolk antibody. Meanwhile, we reviewed research status and application of yolk antibody in China and foreign on aspects of medicine. Comprehensive overview for the development and application of anti-zoonotic disease, diagnostic applications, anti-snake venom and anti-fertility products were discussed.

yolk antibody; advantage of nature; zoonoses; biological products

Shao Min, Email: sm780909@163.com

贵州省科技厅基金项目(黔科合SY字(2012)3091)和2010年遵义医学院青年科研启动基金资助

邵敏，Email:sm780909@163.com

遵义医学院珠海校区生物工程系，珠海 519041

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.02.018

R392.11

A

1002-2694(2015)02-0179-04

2014-07-14；

2014-10-25

Supported by the Guizhou Province Science and Technology Department Fund (Guizhou Branch of SY Word (2012) 3091), and the 2010 Zunyi Medical Youth Scientific Research Foundation