紫衫醇对脊髓损伤后神经细胞骨架微管作用研究进展①

王玉明，唐丽，杨德刚，杨华东

紫衫醇对脊髓损伤后神经细胞骨架微管作用研究进展①

王玉明1，唐丽2，杨德刚1，杨华东1

促进脊髓损伤后轴突再生的药物一直受到高度关注。神经元轴突生长、延长与分枝是细胞骨架介导的生物学过程，微管对轴突结构调整与生长起重要作用。药物紫衫醇能适度稳定微管，消除轴突再生的阻碍，对脊髓损伤后轴突再生修复有影响。紫衫醇主要用于抗肿瘤治疗。本文就紫衫醇与神经元细胞骨架微管的研究进展进行综述。

紫衫醇；脊髓损伤；微管；综述

[本文著录格式]王玉明，唐丽，杨德刚，等.紫衫醇对脊髓损伤后神经细胞骨架微管作用研究进展[J].中国康复理论与实践, 2015,21(4):387-390.

CITED AS:Wang YM,Tang L,Yang DG,et al.Advance of application of taxol in microtubule skeleton function of nerve cells after spinal cord injury(review)[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(4):387-390.

促进轴突再生是脊髓损伤修复研究的热点[1]。神经元轴突生长、延长与分枝是细胞骨架介导的生物学过程。脊髓损伤后微环境中的抑制分子不管通过哪种途径传递抑制信号，最终作用于细胞骨架来抑制轴突再生，可以此为靶点来选择药物促进脊髓损伤后轴突再生[2-3]。促进脊髓损伤后轴突再生的药物和各种影响因素受到高度关注。研究发现紫衫醇(taxol)能适度稳定微管，消除轴突再生的阻碍[4]。

1 神经元细胞骨架的概念以及其在轴突生长过程中的特点

1970年，Yamada等的研究表明，肌动蛋白丝与微管是神经元的主要细胞骨架，肌动蛋白丝对保持生长锥形态和正确的伸展方向起重要作用，微管对轴突结构调整与生长起重要作用。

细胞骨架的动态性组装与转运是轴突生长的分子基础。轴突生长主要发生在生长锥内，其内的细胞骨架更具动态性，调控生长锥内细胞骨架的动态性是调控轴突生长的关键。无论哪一种细胞内信号途径要实现对神经元轴突生长的影响最终都是通过作用于生长锥细胞骨架来实现。

许多研究者探寻轴突生长与细胞骨架的关系、细胞骨架之间的相互关系以及调控细胞骨架的信号机制，寻求促进脊髓损伤后轴突再生的方法[3]。

1.1 生长锥

生长锥是位于轴突远端的膨大，具有高度的结构动态性，分为三个部分：①周围区，是位于生长锥周边的区域，主要细胞骨架呈云雾状的板状伪足(主要为肌动蛋白网络)与丝状伪足(主要为肌动蛋白束)；②中央区，是轴突末端相对膨大、变厚的区域，主要细胞骨架是动态性的微管，肌动蛋白丝在该区逐渐减少或消失；③过渡区，位于生长锥起始部的中央区域，介于中央区与周围区之间，主要细胞骨架是较短的肌动蛋白丝和

弧状肌动蛋白丝，此处的肌动蛋白丝主要由周围区逆流而来，在此发生动态性改变。

在过渡区与中央区周围，弧状肌动蛋白丝与肌球蛋白Ⅱ(具有收缩力的动力蛋白)产生环形压缩力，压缩未成束的微管，促进微管在此处聚集成束并转运，细胞骨架在此完成动态性转变。

生长锥内丝状伪足与板状伪足不断延伸与回缩，其结构并不是固定不变的。周围区内的微管通过聚合与解聚，引导微管快速延伸与回缩，生长锥内的微管可在散开状、绳状与弯曲状之间迅速转换，因此微管与肌动蛋白丝在生长锥内呈流动状态，在其引导边缘表现出不断的突起与回缩[3]。

Bamburg等观察微管断裂剂秋水仙酰胺、微管稳定剂紫杉醇、去稳定剂噻氨酯哒唑对鸡背根神经节神经元胞体以及生长锥对轴突生长的影响时，发现生长锥对这些药物异常敏感，很小剂量即可影响轴突生长；而同一种药物在胞体即使用100倍于生长锥敏感剂量，影响也较小。

Bentleey等观察到，神经元生长锥的丝状伪足与板状伪足消失、末端扩大，虽其胞体仍可长出多个轴突，但方向混乱。因此在轴突生长过程中，生长锥内的肌动蛋白丝与微管聚合、组装，引导轴突运动与延伸。

1.2 神经元肌动蛋白丝

肌动蛋白丝由两股呈螺旋状排列的非对称性肌动蛋白单体组成。肌动蛋白单体主要有β、γ，由核糖体在胞体内合成，以结合三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate,ATP)、二磷酸腺苷(adensine diphosphate,ADP)、ADP-pi(ATP释放磷酸成ADP的中间形式)的形式存在，在生理状态下，单体可逆性地聚合成丝。肌动蛋白以单体或短的肌动蛋白丝分散在细胞体中。单体按从头至尾的方式聚合成肌动蛋白丝，或直接在肌动蛋白丝尾端聚合延长，形成具有聚合能力的球状末端与解聚能力的尖端，因此肌动蛋白丝是具有极性的聚合物[3]。

在细胞内，肌动蛋白丝通过球状末端亚单位的磷酸化修饰来调节其活性、稳定性、定位及循环。聚合的肌动蛋白丝通过组装成束，或通过肌动蛋白连接蛋白(actin binding proteins, ABPs)组装成高度有序的结构，被肌球蛋白Ⅱ交联的肌动蛋白丝具有收缩能力，影响细胞形态；ABPs还通过与不同形式的肌动蛋白亚单位或肌动蛋白丝结合，影响其聚合与聚合后的状态，调节肌动蛋白丝的动态性。

在轴突内，肌动蛋白组装成平行于膜与轴突管的肌动蛋白丝，以稳定的形式转运。

在生长锥内，肌动蛋白丝主要组装成束和疏松的肌动蛋白丝网络；此外，动态性的、彗星样板间丝存在于周围区与过渡区之间，动态性的、弧形肌动蛋白丝存在于过渡区，稳定性的、斑点状肌动蛋白丝存在于中央区。因此在生长锥内，动态性和稳定性肌动蛋白丝并存[3]。

在生长锥内，板状伪足与丝状伪足内的肌动蛋白丝球状末端均指向引导边缘，而尖端指向生长锥中央的过渡区；在周围区，ATP的肌动蛋白亚单位不断沿生长锥方向运动，并在引导边缘水解成ADP-pi肌动蛋白后聚合，释放磷酸形成ADP肌动蛋白，在肌球蛋白Ⅱ的作用下，肌动蛋白丝逆流向生长锥的中央区；在中央区，肌球蛋白Ⅱ环形压缩肌动蛋白束(可被引导边缘的肌动蛋白丝的聚合加强)，在肌动蛋白解聚因子(actin-depolymerizing factor,ADF)作用下切断、解聚形成ADP肌动蛋白；重新结合ATP后形成ATP肌动蛋白，又开始肌动蛋白丝新的循环运动，其运动形式象“布朗运动”或“踏车运动”，因此肌动蛋白丝逆流赋予了生长锥内肌动蛋白丝的动态性。

Dent等的研究表明，调节肌动蛋白丝的动态性，不仅影响轴突生长的方向，而且还影响微管在生长锥内的状态与转运，进而影响轴突的生长。只有当肌动蛋白束去组装而不影响肌动蛋白丝回流时，才能促进轴突生长[5]。

1.3 神经元微管

微管是长而直、没有分枝、中空的圆柱状蛋白管，外径25 nm，内径10 nm，管壁由11～15根原丝组成，在表面形成5× 4 nm的网格。每根原丝由α、β亚单位以异二聚体的形式呈线性、交替排列而成。微管是无共价键的聚合物，微管异二聚体按平行于微管纵轴的方向从头至尾聚合，形成有聚合能力的“加尾”端和有解聚能力的“减尾”端，通过加尾端聚合微管异二聚体完成微管的生长与延伸。因此，微管具有极性[3,6]。

单根微管具有两个结构域：①富含糖基化的微管与去酪氨酸化微管，它可对抗微管解聚剂的作用；②富含酪氨酸化的微管，主要位于加尾端，对微管解聚剂敏感[3,7]。两个结构域之间可以相互转换。微管亚单位通过酪氨酸化/去酪氨酸化、糖基化、磷酸化、聚谷氨酰化、聚乙酰化等修饰，影响微管相关蛋白(microtubule-associated proteins,MAPs)、微管与其他细胞骨架的相互作用和细胞内信号传导[3,8]。

微管在中心体合成组装后，顺向转运至轴突。在轴突内，微管被MAPs稳定组装成束并沿轴突方向排列。它对微管解聚药物不敏感，不具有动态稳定性。生长锥内微管具有高度动态不稳定性，抑制微管的动态性可引起轴突生长抑制与轴突回缩；只有稳定微管组装而不影响微管聚合时，才能促进轴突生长[9]。微管二聚体或微管加尾端与MAPs连接，调节微管的聚合、稳定与转运，从而调节微管的动态性，同时还调节与肌动蛋白丝的交链。

轴突生长过程中，生长锥内肌动蛋白丝与微管相互作用，改变微管与肌动蛋白丝的动态性，影响它们之间的相互作用，从而影响生长锥的行为。肌动蛋白丝与微管之间的动态协调作用，在轴突延伸与转向过程中具有重要意义[3]。

轴突生长时，神经元细胞骨架通过下列3个连续过程实现轴突生长。①以肌动蛋白为基础结构的丝状伪足最先接触感知外环境，在生长锥的引导边缘，丝状与板状伪足延伸通常在二者之间形成突起，引导轴突生长的方向[3,10]。②生长锥中央区的微管和细胞器向周围区转运，微管在此过程中主要发挥轴突结构支撑与细胞器的转运功能[11]。③周围区的肌动蛋白丝与肌动蛋白网络回流至过渡区，并与中央区的微管耦合相互作用。

在这一过程中，丝状伪足不断延伸与回缩，板状伪足和形成的膜泡一过性延伸与塌陷，形成了生长锥的动态性。这种动态性取决于肌动蛋白丝动态性，因为肌动蛋白丝一方面要不断组装成束，同时又要不断回流至过渡区，形成弧形肌动蛋白并解聚。微管向周围区快速转运与肌动蛋白丝回流减慢相一致，受微管的动态不稳定性，肌动蛋白丝的聚合、组装和肌球蛋白Ⅱ收缩性的调控。微管进入周围区后，其稳定、生长和转运受自身的动态不稳定性与肌动蛋白丝动态性的调节[10,12]。

因此轴突生长的实质就是协调肌动蛋白丝与微管以及它们之间相互作用的动态性。

Ertürk等发现，脊髓轴突切断后1～35 d轴突逐渐回缩，末端生长锥呈球状，其表面积随时间逐渐变大；回缩末端线粒体的密度和转运高尔基体的小平滑膜泡密度明显增加；稳定性的去酪氨酸化微管与动态性的酪氨酸化微管的比例增加，稳定性的微管高度去组装，方向混乱，主要堆积在生长锥的中央；T12节段半侧损伤的脊髓局部反复应用紫杉醇，回缩的球状末端明显减少，生长锥变小，轴突的退变减少。由此可知脊髓损伤轴突断裂后能很快形成生长锥，生长锥内细胞骨架的动态性也同样介导了神经损伤后轴突的再生[13]。

细胞生物学研究表明，神经元内的Rho-GTP酶和糖原合成酶激酶这两个关键分子主要参与细胞骨架动态性的调节[6]。神经元可通过RhoA/ROCKⅡ信号途径调控神经元细胞骨架，特别是肌动蛋白丝动态性。脊髓损伤后影响肌动蛋白丝动态性的细胞内信号最有可能通过RhoA/ROCK II途径实现。糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，具有α、β两种同源异构体，虽然GSK-3α在脊椎动物的其他组织广泛表达，但GSK-3β最多表达在成年中枢神经系统的神经元胞体与树突。GSK-3β通过作用于多种MAPs来调控细胞骨架，进而调节微管的动态性[12,14-15]。

2 影响微管的特异性药物

紫杉醇是红豆杉属植物中的一种复杂次生代谢产物，也是目前惟一能促进微管的装配，并使已形成的微管稳定的药物。紫杉酚只结合到聚合的微管上，不与未聚合的微管蛋白(tubulin)二聚体反应。重水(D2O)也会促进微管装配，增加其稳定性。由紫杉醇和重水所致的微管稳定性增加对细胞有害，使细胞周期停止于有丝分裂期。为行使正常的微管功能，微管处于动态的装配和解聚状态是重要的。秋水仙素(colchicine)阻断微管蛋白组装成微管。

紫杉醇是重要的抗肿瘤药物，可以影响a、b微管蛋白二聚体与微管间的动态平衡，促进微管蛋白组装成微管，并使已形成的微管稳定，可以将细胞阻滞在有丝分裂期。紫杉醇的作用是通过与b微管蛋白的结合进行的，其结合位点是b微管蛋白结合GTP/GDP的结构域，而GTP/GDP的转化是提高或降低微管稳定性的主要调控机制。紫杉醇与该位点的竞争结合，所形成的构象类似于同GTP的结合，有利于微管的稳定。

高浓度的紫杉醇能够使微管多聚体增加，并在分裂间期的细胞中引起微管束形成。低浓度时，紫杉醇可以诱导细胞形成不正常的纺锤体，从而阻止细胞分裂进程，进而抑制细胞增殖。

3 紫杉醇在脊髓损伤中调节微管结合蛋白的作用

国内外对紫杉醇在脊髓损伤中的调节微管的作用已有初步研究。谢中光电镜观察发现，脊髓损伤后，脊髓微管略粗、直径25 nm左右，分布散乱，走向不规则，为单管形式，中空，未见管中心有细丝；位于轴突主干者，微管甚多，多居边，界呈纵行，弯曲者不多见。轴突结间往往只有数根微管，呈纵行。突触内甚少，偶可见，未见有突触小泡回绕，树突内亦有微管，但数量少，仅棘突内无。

伤后30 s内，即见神经细胞体和胞突内微管明显减少，胞突未见有微管存在。随着时间延长和神经纤维的溃变，微管甚而完全消失。但24 h后，在完整神经纤维中偶可见发现。

微管是无膜细胞器，不分枝的直管以微管蛋白为基本化学单位，特别在神经元胞突中乃不可缺乏的骨架。微管具有运输作用，线粒体的位移与微管有关。微管含有某些活性酶，对低温、压力、某些药物(秋水仙碱等)敏感，能被其解聚或破坏而丧失功能。冲击力对微管产生重要影响，30 s后可见其解聚而数量减少。

肥厚性胶质瘢痕和神经轴突本身生长能力弱，是脊髓再生的主要障碍，微管动力学调节这些过程。瘢痕之间的微管动力学主要进程包括细胞增殖、迁移、分化、细胞内运输和细胞外基质分子的分泌[16-17]。微管适度稳定能阻止损伤后的轴突回缩和轴突顶端增大，克服中枢神经系统髓脂的生长抑制作用[13]。

杨亚林在大鼠慢性脊髓损伤模型上，予紫杉醇干预治疗。结果显示，紫杉醇可以减轻大鼠脊髓损伤后损伤部位炎症反应，减轻组织破坏程度，减弱反应性胶质化，缩小胶质瘢痕，改善大鼠后肢运动功能，提示应用紫杉醇治疗可能有助于大鼠脊髓损伤后有效的神经通路重建。低剂量的紫杉醇并不影响脊髓损伤后诱发的细胞死亡。因此，紫杉醇在低剂量时，通过独立于细胞增殖或凋亡外的机制减少纤维化瘢痕形成。紫杉醇能抑制星形胶质细胞增生和胶质瘢痕形成，对慢性脊髓损伤有保护作用[18]。

紫杉醇可增加抗微管蛋白的水平，使驱动蛋白-1紧紧地约束微管[19]。紫杉醇强烈地改变细胞内驱动蛋白-1和动力蛋白的运输[20]。低剂量紫杉醇阻碍了脊髓损伤后的纤维瘢痕。紫杉醇还可促进5-羟色胺阳性轴突尖端生长锥样结构的形成。另外，中枢神经系统损伤后，轴突内微管分解，难以为轴突向外生长提供必要的外向生长压力。微管的适度稳定消除了阻碍轴突再生的各种细胞内机制的进程。

段红梅认为，紫杉醇可能通过两个途径抑制瘢痕的增生：①直接抑制成纤维细胞的生长增殖，从而减少胶原的合成和分泌；②使增生性癒痕Ⅳ型前胶原mRNA表达减少，增加胶原酶产生、增强胶原Ⅰ活性，促使已形成的胶原纤维降解和纤维重吸收比例趋向平衡，使瘢痕变平、变薄[21]。

紫衫醇的特性受到研究者高度关注。作为抗肿瘤药物，应用相对普遍，临床安全性等已经被证实。需进一步研究其对脊

髓损伤后轴突再生的影响。

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Advance of Application of Taxol in Microtubule Skeleton Function of Nerve Cells after Spinal Cord Injury(review)

WANG Yu-ming1,TANG Li2,YANG De-gang1,YANG Hua-dong1
1.Department of Spinal and Neural Functional Reconstruction,Beijing Bo'ai Hospital,China Rehabilitation Research Center,Beijing 100068,China;2.Capital Medical University School of Rehabilitation Medicine,Beijing 100068,China

The drugs promoting axon regeneration after spinal cord injury has been receiving high attention.Growth,extending and branching of neuron axon is a biological process mediated by cytoskeleton,and microtubule plays an important role on axon structure adjustment and growth.Taxol can reasonably stabilize microtubules,eliminate the obstacles of axon regeneration,and effect on axonal regeneration repair after spinal cord injury.Taxol is mainly used for anti-tumor therapy.This paper reviewed the researches on taxel and neuronal cytoskeletal microtubule.

taxol;spinal cord injury;microtubule;review

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.04.004

R651.2

A

1006-9771(2015)04-0387-04

2014-07-25

2014-09-19)

1.中国康复研究中心北京博爱医院脊柱脊髓神经功能重建科，北京市100068；2.首都医科大学康复医学院，北京市100068。作者简介：王玉明(1965-)，男，汉族，内蒙古包头市人，硕士，副主任医师，主要研究方向：骨科和脊柱脊髓损伤。