量子点遗传毒性研究进展

何克宇，唐萌（教育部环境医学工程重点实验室，东南大学公共卫生学院&苏州纳米科技协同创新中心；江苏省生物材料与器件重点实验室，江苏 南京 210009）

量子点遗传毒性研究进展

何克宇，唐萌
（教育部环境医学工程重点实验室，东南大学公共卫生学院&苏州纳米科技协同创新中心；江苏省生物材料与器件重点实验室，江苏 南京 210009）

有关量子点（QD）的遗传毒性作用研究取得了一定进展。研究显示，QD进入内环境后通过产生活性氧和释放有毒内核离子这两种机制产生遗传毒效应。彗星实验及微核实验表明，QD产生的遗传毒效应主要是DNA损伤和染色体畸变。DNA损伤和染色体畸变的程度受多个影响因素控制：QD浓度越高毒效应越强；QD粒径越小越易进入细胞核并产生遗传损伤；表面带负电荷的QD毒性更强；裸核QD的毒性比外壳包覆的QD毒性强。另外，QD在不改变细胞遗传物质的条件下，通过表观遗传学改变也可产生遗传效应，使有害效应持续存在。

量子点；DNA损伤；活性氧；纳米材料

量子点（quantum dots，QD）因其独特的光学、电学特性被广泛应用于各个领域，尤其是生物医学和生物科技领域［1-2］。在为人们带来进步和便利的同时，QD的潜在毒性也不可忽视。QD的肺毒性［3-4］、生殖毒性［5-7］和神经毒性［8-9］等毒性已被全球多个实验室证实，QD越来越广泛地应用也增加了暴露风险。深入进行QD的毒理学研究工作，阐明QD对健康的影响和机制，并采取相应技术手段（如化学修饰等）降低QD毒性，将QD毒性控制在可接受范围，才能使QD更为安全地应用于各个领域。本文就QD的遗传毒性、毒作用机制、毒作用影响因素以及表观遗传毒性方面进行了综述。

1 QD遗传毒性

遗传毒性是指外源化学物对遗传物质产生损害的能力，遗传毒性实验是毒理学安全性评价中必不可少的环节，所以在过去的近20年中，国内外学者们通过各种实验对QD的遗传毒性已经有了初步的描述和评价。

QD的遗传毒性表现主要是氧化应激造成的DNA断裂和染色体畸变，而埃姆斯实验（基因突变）多呈阴性［10］。染色体数目异常相关研究未见相关报道。

1.1 DNA损伤

单细胞凝胶电泳实验又称彗星实验，是一种快速检测单细胞DNA损伤的实验方法。通过彗星实验已对多种QD的DNA损伤作用进行了验证。Rocha等［11］使用碲化镉量子点（CdTe QD）对贻贝染毒3，7和14 d，各染毒组淋巴细胞均发生DNA损伤，且损伤随时间加重。Katsumiti等［12］使用硫化镉量子点（CdS QD）对贻贝血细胞染毒，彗星实验结果显示导致DNA损伤。李艳博等［13］使用巯基乙酸包覆的CdTe QD 12.50，25.00和50.00 mg·L-1染毒人正常肝HL-7702细胞24 h，均出现显著性DNA损伤，并且DNA损伤率随浓度升高也逐渐升高。Munari等［14］观察到CdS QD 0.01～1.00 mg·L-1染毒RTG-2细胞24 h，各浓度组均有显著性DNA损伤，并且损伤程度呈浓度-效应相关趋势，但暴露48 h后，上述浓度组均不出现显著性DNA损伤，考虑是细胞自身DNA损伤修复的结果。Aye等［15］采用ip给药方式，用经修饰具有脂/水两亲性的硒化镉/硫化锌量子点（CdSe/ZnS QD）对大鼠进行染毒，并取不同组织细胞进行彗星实验分析，结果显示，脑、肝和睾丸组织细胞均可观察到显著DNA损伤，而在肾和肺组织细胞中未观察到显著DNA损伤。说明QD在进入机体后分布具有一定靶向性，可以在特定部位蓄积并产生相应毒效应，同时QD经修饰后能通过生物屏障并对靶组织产生损伤。当然各组织器官受损程度还可能与其特殊的代谢反应和对损伤的修复能力有关，不同组织受损的具体机制仍待探讨。除彗星实验外，QD染毒细胞其他生化实验结果也支持DNA损伤这一结论。Ju等［16］使用γ-组蛋白2A变异体焦点形成作为判断DNA断裂的指标，结果也证明了QD具有DNA损伤作用。

1.2 染色体畸变

染色体畸变是较为严重的遗传损伤。通常用光学显微镜在细胞有丝分裂中期即可见，谢广云等［17］通过镜下染色体畸变分析观察到CdTe QD可致经代谢活化的CHL细胞畸变率显著性升高。在外周血微核实验中，ip给大鼠CdSe/ZnS QD 0.05 μg·kg-1即可出现外周血网织红细胞微核率显著性上升，并且微核率与染毒剂量之间存在正相关关系［15］。CHO细胞是体外微核实验常用细胞，经CdSe/ZnS QD染毒后，在最低染色体断裂浓度3.8 μg·L-1，同样出现了微核率的显著上升［10］。

另外也有诸多证据表明，QD可通过调节凋亡相关基因和影响凋亡信号转导通路两种方式诱导细胞凋亡。QD可通过诱导胱天蛋白酶家族表达、下调p53和Bcl-2基因表达、能使细胞凋亡因子Fas系统和干预线粒体等介导的凋亡信号通路诱发细胞凋亡［18-19］，而细胞凋亡的重要特征就是DNA片段化和染色质固缩。

目前关于QD遗传毒性研究的观察终点是类似的，根据损伤程度大小可分为DNA断裂和染色体断裂。损伤大小一定程度上取决于染毒剂量和染毒时间，染毒剂量越高损伤程度越严重，而染毒时间对损伤程度的影响有别，在一定染毒时间内QD可对DNA产生显著损伤，若损伤程度控制在一定程度内，由于细胞自我修复机制，损伤可在一定时间内被修复而呈现阴性结果。

2 QD遗传毒性机制

目前关于QD引起遗传毒性效应的完整机制尚无定论，但国内外专家的观点主要集中在活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成和QD内核释放这两方面原因。

2.1 活性氧生成

蛋白质磷酸化是细胞信号传递过程重要环节，ROS可通过影响多种蛋白激酶、磷酸酶发挥细胞调节作用。ROS对激活因子蛋白-1和NF-κB家族也有重要调控作用［20-21］。过量ROS生成可对细胞造成严重氧化损伤。研究证实，CdTe QD能生成单线态氧（1O2）［22］。同时QD染毒能引起ROS升高，多个实验已证实QD染毒可激活细胞DNA修复［23］，引起超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶等抗氧化酶的升高［24］。1O2在QD的作用下在细胞内可进一步产生其他ROS，如羟自由基（·OH）和过氧化氢（H2O2）。·OH能够夺取DNA胸腺嘧啶上甲基的氢原子和核糖的氢原子，也能插入到与胸腺嘧啶C5=C6双键，形成各种羟基衍生物，致使DNA损伤［22］。Anas等［22］认为，ROS对DNA碱基的损伤有两种方式，一是鸟嘌呤与1O2之间发生电子转移，从而产生鸟嘌呤阳离子自由基最终形成8-羟基鸟嘌呤核苷。另一种方式是·OH直接插入到鸟嘌呤核苷的C8位置形成8-羟基核碱基，随后重新排列为8-氧鸟苷或2，6-二氮基-5-甲酰-4-羧基鸟嘌呤。

此外，外源抗氧化剂的应用能减少遗传损伤，也使ROS能部分解释QD遗传毒性。Aye等［10］发现，CdSe/ZnS QD 3 mg在黑暗条件下可引起DNA显著损伤，抗氧化剂麦角硫因使其毒性作用降低50%。Luo等［25］的实验也证实了抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）对QD染毒细胞DNA的保护作用。

上述实验证明，QD能产生1O2以及其他ROS，QD对细胞染毒后细胞内ROS升高，持续对DNA产生损伤作用。其机制主要是ROS能与DNA碱基结合形成各种羟基衍生物，破坏DNA结构。细胞内ROS升高会激活细胞自身抗氧化途径，细胞内超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等升高可作为ROS生成和细胞氧化应激状态的生物标识，这些抗氧化酶以及抗氧化剂的使用能减少ROS产生的遗传损伤，促进细胞自身修复。

2.2 QD内核释放

除了细胞内过量ROS释放之外，还有一部分研究者认为QD内核释放也能一定程度上解释QD遗传毒性。由于机体内部环境复杂，QD在进入机体后经过一系列的消化、代谢可导致QD外壳被破坏，内部金属离子释放，产生或增强遗传毒性效应。

经研究证实，经光照或酸性环境处理后，QD的毒性显著上升［10］，与环境因素导致外壳被破坏、QD内核释放有关。实验常采用以镉为内核的QD，镉能抑制DNA甲基化，也能与位于DNA大沟的鸟嘌呤结合导致碱基损伤［26］，在浓度＞1 μmol·L-1时能抑制DNA合成，而＜1 μmol·L-1时会增强DNA合成和细胞增殖［27］。Cd2+不仅能损伤DNA，还能抑制DNA修复。实验表明，Cd2+能抑制一些DNA修复蛋白，其中包括错配系统中的Msh2-Msh6复合物和Msh2-Msh3复合物、核苷酸修复系统的着色干皮病A蛋白以及碱基切除修复系统的甲酰胺基嘧啶糖基化酶、人类8-氧鸟苷DNA糖苷酶、脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶和多聚ADP核糖聚合酶［10］。

研究证实，核壳结构的QD遗传毒性要远远小于裸核QD［27］，使用QD外壳材料甲基聚乙二醇（methyl polyethylene glycol，M-PEG）与M-PEG包裹的CdS QD染毒细胞，实验结果表明，在相同条件下M-PEG包裹的CdS QD具有遗传毒性而单独的M-PEG外壳并无遗传毒性［14］。

上述实验说明，QD的遗传毒性来源于内核，QD毒性与其内核的离子毒性具有相似性，QD内核的释放会产生或加重QD的遗传毒性。然而内核释放也不能完全解释QD遗传毒性。有研究发现，在Cd2+浓度相同的条件下，以镉为内核的核壳结构的QD毒性要高于CdCl2溶液［24］。还有研究结果恰恰相反，常规CdS毒性高于CdS QD［29］，说明QD的遗传毒性不完全是由其内核毒性的作用。这两种机制之间不是孤立的，而是相互联系的。镉离子能导致细胞内ROS的升高而引起的DNA氧化损伤，细胞内ROS升高能提供一个氧化环境，QD表面氧化会促进内核的离子释放［30］。有研究显示，低浓度下细胞毒性的主要机制是ROS过量，而随浓度升高主要毒作用机制就由ROS过量变为Cd2+释放，故在一定浓度内镉QD毒性要高于传统镉［31］。另外，也有报道QD能引起细胞内钙显著升高［8］，内钙升高导致钙依赖性内源性核酸酶激活，也可能是QD遗传毒性机制之一。

3 影响QD遗传毒性的因素

3.1 QD浓度

QD的遗传毒效应在多项实验中呈现剂量依赖，超过一定阈剂量后才能产生遗传毒作用，虽然由于实验对象的差异和实验条件的不同，阈浓度可能相差较大，但超过阈浓度后通常都可观测到随浓度升高产生损伤也越严重的趋势［12-15，32］。浓度依赖的产生可能是由于大量QD产生过量ROS，超过细胞氧化应激代偿水平，造成一系列DNA损伤。而使用抗氧化剂NAC后，能升高阈浓度，减少DNA损伤［25］，NAC的保护机制有3个方面［33］：①NAC的巯基使其可黏附在QD表面，使QD稳定，减少ROS产生；②NAC自身就具有抗氧化以及提高谷胱甘肽表达水平的能力；③NAC还能激活抗凋亡信号转导通路使存活基因表达，对抗应激状态。

3.2 QD种类与粒径大小

Munari等［14］使用M-PEG包裹的CdS QD （4 nm）和Ag2S纳米粒子（13nm）对RTG-2染毒，彗星实验结果表明，CdS QD在0.01 mg·L-1浓度下即可产生遗传毒性，而Ag2S纳米粒子在各浓度下均未表现出显著性DNA损伤。产生这种差异的原因有可能是QD内核不同，也有可能是粒径的差异，致使两种纳米粒子在细胞内的分布不同以及生物活性差异，使得结局不同。

由于纳米粒子特殊的表面效应，使其毒性通常要大于同种常规材料，QD内核粒径越小生物活性越强，毒性损害也越大。然而，即使同属纳米级别的2种QD，粒径上的微弱的差异仍会产生毒效应的区别。Ju等［34］就使用了两种内核尺寸的CdSe QD （QD-440nm、QD-680 nm）进行对照实验，在对HSF-42细胞染毒2 h后，QD-680 nm的毒作用便趋于稳定，而QD-440 nm DNA损伤则能持续＞24 h，说明内核粒径越小，QD表现出的生物活性也越强。Lovric等［35］还观察到两种尺寸分别2.20 nm和5.30 nm的CdTe QD在细胞内分布的差异，两种QD的平均直径，粒径为5.20 nm的QD对N9细胞染毒后主要分布在细胞质，并未进入细胞核；粒径为2.20 nm的QD在染毒相同时间后，则主要分布于细胞核。2种QD粒径均小于细胞核膜通道直径9 nm，但却在细胞核中呈现完全不同的分布。其机制可能是在细胞环境中，在生物介质的作用下，多个QD形成共聚体，或者QD与其他细胞蛋白形成复合物，使其实际粒子直径增大。而2.20 nm的QD形成的聚合物、复合物较小或者更加不稳定，致使两种粒子通过核膜孔的能力不同。Ipe等［36］的实验观测到，在紫外线照射下，CdSe QD只产生·OH而CdS QD既能产生·OH也能产生超氧自由基（O-2·），说明不同内核可能造成代谢产物的种类、数量以及代谢速率的差异，最终导致毒性效应的不同。

3.3 QD外壳及表面修饰

利用包覆材料减小QD毒性是将QD技术安全应用于生物医学的重要手段。QD外壳对QD遗传毒性的影响也是十分显著的，在多个裸核QD与核壳结构QD的对照实验中已经证实，无毒的包覆材料能减少甚至消除QD的遗传毒性［28，37］。

QD外壳的差异主要表现在外壳的材料、厚度、表面电荷以及功能基团的差异［36］。Galeone等［1］使用巯基烷酸、聚马来酐十八碳烯、聚马来酐十八碳烯-PEG包被CdSe/ZnS QD染毒果蝇血细胞，结果表明，3种QD的生物蓄积量不同，巯基烷酸＞聚马来酐十八碳烯＞聚马来酐十八碳烯-PEG，对DNA产生的损伤程度也不同，其严重程度与蓄积量呈正相关。Pathakoti等［38］也对多种外壳材料对QD遗传毒性的影响进行了实验，结果显示聚醚酰亚胺包覆和胺修饰的CdSe/ZnS QD遗传毒性较明显，而PEG包覆的各类QD几乎没有遗传毒性。这可能是由于聚醚酰亚胺包覆的QD不仅能进入细胞膜，还能引发“质子海绵效应”，即聚醚酰亚胺大量捕获质子，并引起Cl-内流，导致溶酶体渗透性肿胀、破裂，颗粒释放，进入细胞质，进一步导致线粒体损伤和细胞凋亡［39］；另外，其毒性也可能来自于表面带正电的胺基基团。Hoshino等［40］使用各类化学基团修饰QD，表面电荷负电位最高的QD-COOH遗传毒性最为显著。

上述研究结果表明，QD的浓度、粒径、内核材料、外壳材料、表面修饰等都能影响QD遗传毒性。不同QD产生毒性差异的原因首先是内核本身毒性大小不同，相同条件下，内核毒性高QD整体毒性也高，QD毒性与常规离子的毒性有一定的相似性。外壳材料的特点影响着有毒内核释放的概率，如果环境中QD外壳破裂相关率大，细胞内内核离子浓度也会相对较高，另外，有些外壳材料或经修饰的外壳材料本身就具有毒性，能促进细胞ROS生成或协助QD穿透生物膜结构，提高毒性。由于QD的表面效应，QD尺寸影响着QD的反应活性，理论上粒径越小的QD其反应活性越强，毒性也就越强。另外，QD的大小还决定着QD穿过各生物膜的能力，继而影响QD在细胞中的分布，造成不同尺寸QD直接攻击的靶位不同。

4 QD表观遗传毒性

研究发现，QD不仅能造成遗传物质损伤，还可能改变基因尤其是与凋亡相关基因的表达水平［41］。Ambrosone［42］观察到了CdTe染毒引起的凋亡相关基因myc1、胱天蛋白酶3、bcl-2表达水平改变，也检测到应激相关蛋白，如叉头框蛋白O类和热休克蛋白70水平的改变。金属硫蛋白（metallothionein，MT）基因家族转录翻译的MT蛋白能调控真核生物细胞及组织内锌的水平和分布。另外，MT还有保护细胞，防止有毒金属和氧化应激损伤的功能。Chen等［43］使用不同浓度碲化镉QD（37.70和300.00 nmol·L-1）染毒HEK293细胞，染毒组细胞MT家族基因（MT-1A，MT-1B，MT-1E，MT-1F，MT-1G，MT-1H）表达均显著上调。

目前，关于QD引起基因表达水平改变的机制认为，组蛋白是真核生物细胞核内与DNA结合的碱性蛋白，组蛋白在表观遗传调控中的作用，如基因表达调节、DNA损伤修复、染色质状态调控、细胞分化［44］等越来越受到重视。未经修饰的QD表面带负电，能在人类细胞核内、核仁上快速蓄积，并优先结合带正电的内核组蛋白形成QD/蛋白质加合物［45］。加合物的形成可能会影响组蛋白的调控作用，从而激活、抑制基因或改变基因表达水平。

内核释放可能是QD表观遗传毒性作用机制之一。其中最常见、研究最多的内核就是镉离子（Cd2+），Cd2+能抑制DNA甲基化、干扰E钙蛋白介导的细胞黏附作用［26］，同时又能模拟金属应答元件结合转录因子的Zn2+，从而影响细胞周期、增殖和分化，干扰DNA表达、复制和修复。对于含有Cd2+QD抑制雌激素水平同时又表现出雌激素样作用的现象［5，46］，研究者们提出了一些猜想：雌激素核受体的C区是与DNA结合的重要结构域，Cd2+能与C区结合，影响雌激素受体对相应DNA序列转录调控的作用［7］。另外，某些毒物能模拟内源性配体作用继而调节其下游基因的表达，所以也可能是Cd2+取代C区锌指中的Zn2+，使其直接与雌激素反应元件结合有关［6］。

QD通过干扰基因转录、翻译过程使基因非正常表达，产生与直接改变遗传物质类似的结局，这些不良结局可被修复也可能产生遗传效应，属于表观遗传毒理学的研究范畴。QD表观遗传毒作用机制与遗传毒性机制有的相似，如两种主要遗传毒性机制ROS生成和内核粒子释放也能引起表观遗传改变，造成细胞内mRNA和蛋白质数量、种类异常。当然，QD表观遗传毒性机制也有其特殊性，如QD还可通过与组蛋白结合，干扰组蛋白转录调控功能。

5 展望

QD遗传毒性特点、机制尚未形成定论。对于遗传损伤的检测仍是较高剂量下会出现较为严重的DNA断裂、染色体畸变甚至细胞凋亡，今后应更加关注更小剂量下碱基、基因序列及组蛋白等生物学改变。目前关于QD毒性机制的猜测主要集中与ROS过量和内核粒子释放两方面，但都不能完美解释迄今为止观察到的遗传损伤现象，两种猜想其实又是相互关联的，氧化环境能促使内核释放，内核释放又能增加ROS释放，所以两种机制共同研究，寻找两者之间的联系，共同解释QD遗传毒性是今后研究探索的方向。QD遗传毒性影响因素众多，粒子物质理化特性、环境因素、机体因素以及联合作用的差异比较都值得进一步研究。同时QD内核、包覆材料、表面修饰、尺寸及剂量等对于控制QD毒性十分重要，是QD技术能否安全应用的关键所在。

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（本文编辑：乔虹）

Research advances in genotoxicity of quantum dots

HE Ke-yu，TANG Meng
（Ministry of Education Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering，Jiangsu Key Laboratory for Biomaterials and Devices，Collaborative Innovation Center of Suzhou Nano Science and Technology，School of Public Health，Southeast University，Nanjing 210009，China）

The genotoxicity of quantum dots（QDs）has been confirmed by a variety of experiments.When QDs are absorbed in an internal environment，genotoxic effects can be induced in two ways.One is through the generation of reactive oxygen species，and the other is via core release.The comet assay and micronucleus test show that the genetic toxicity effects of QDs are DNA damage and chromosome aberrations.The level of QDs′genotoxicity can be affected by many factors.It has been observed that more severe genotoxicnity can be caused by QDs of smaller size or in higher concentrations. Negative charges modified QDs often show more significant genetic damage.However shelled QDs can be less harmful or even harmless.Besides，the epigenetic toxicity of QDs can make the adverse effect persistent，even to the next generation，without any genetic damage.

quantum dots；DNA damage；reactive oxygen species；nanomaterials

The project supported by National Natural Science Foundation of China（30972504）；National Natural Science Foundation of China（81172697）；National Natural Science Foundation of China（81302461）；National Natural Science Foundation of China（81473003）；NationalImportantProjectonScientific Research of China （2011CB933404）；and Natural Science Foundation of Jiangsu Province（BK2011606）

TANG Meng，E-mail：tm@seu.edu.cn，Tel：（025）83272564

R394

A

1000-3002-（2015）06-01014-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.06.021

国家自然科学基金（30972504）；国家自然科学基金（81172697）；国家自然科学基金（81302461）；国家自然科学基金（81473003）；国家重大科学研究计划项目（2011CB933404）；江苏省基础研究计划（自然科学基金BK2011606）

何克宇，男，博士研究生，主要从事纳米毒理学研究，E-mail：hekeyu@seu.edu.cn；唐 萌，男，博士，教授，博士生导师，主要从事纳米毒理学研究。

唐萌，E-mail:tm@seu.edu.cn，Tel：（025）83272564

（2015-03-02接受日期：2015-06-01）