ICAM-1/LFA-1在早期自然流产患者蜕膜组织中的表达

王立芹，闫晓婷，于学文，褚 静，李 静，李 腾

(1.西安医学院护理系，陕西 西安 710021；2.西安交通大学医学院，陕西 西安 710061；3.西安交通大学医学院第一附属医院，陕西 西安 710061)

ICAM-1/LFA-1在早期自然流产患者蜕膜组织中的表达

王立芹1，闫晓婷2，于学文3，褚 静1，李 静1，李 腾1

(1.西安医学院护理系，陕西 西安 710021；2.西安交通大学医学院，陕西 西安 710061；3.西安交通大学医学院第一附属医院，陕西 西安 710061)

目的 通过观察细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)在早期自然流产患者蜕膜组织中的表达，探讨ICAM-1/LFA-1与早期自然流产的关系。方法 采用免疫组化方法检测33例早期自然流产患者和同期妊娠的30例健康妇女蜕膜组织中ICAM-1、LFA-1的表达，用激光共聚焦显微镜(CLSM)双标检测二者关系并加以分析。结果 流产组患者蜕膜组织基质细胞ICAM-1和LFA-1蛋白表达强度高于对照组(t=-3.632，P=0.001；t=-3.839，P=0.001)；流产组蜕膜腺体细胞ICAM-1和LFA-1蛋白表达强度明显低于对照组(t=-2.613，P=0.013；t=-2.266，P=0.027)；共聚焦显微镜下ICAM-1和LFA-1在流产组和对照组的蜕膜组织均有大部分重叠表达，在蜕膜腺体细胞流产组比对照组重合表达明显。结论 ICAM-1和LFA-1在早期自然流产患者蜕膜组织基质细胞的高表达和腺体细胞的低表达可能与早期自然流产的发生有关。

早期自然流产；细胞间黏附因子-1；淋巴细胞功能相关抗原-1；免疫组织化学；激光扫描共聚焦显微镜；蜕膜

自然流产(spontaneous abortion，SA)是早期妊娠最常见的并发症之一，发病率约占全部妊娠的10%～15%，多数为早期流产。生理妊娠类似于同种异体移植。母胎界面免疫微环境由蜕膜中的免疫细胞及其分泌的细胞因子组成，各细胞因子间相互作用构成复杂的细胞因子网络，一旦失衡，母体会对胚胎产生免疫排斥而导致妊娠失败。细胞间黏附分子-1(intracellularadhesion molecule-1，ICAM-1)又名CD54，属于免疫球蛋白超基因家族成员，与其配体淋巴细胞功能相关抗原-1(lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-1)结合可介导上皮细胞与淋巴细胞间的相互黏附、上皮细胞与单核巨噬细胞的黏附、参与细胞的分化发育、细胞介导的细胞毒作用、炎症反应等生理和病理作用。有研究提示，ICAM-1参与了调节子宫内膜的局部免疫作用[1-2]。Blois(2005年)、Yurdakan(2008年)研究认为ICAM-1有可能与自然流产的发生有关。为了探讨ICAM-1和LFA-1在早期自然流产中的作用，本研究采用免疫组化S-P法检测早期自然流产患者蜕膜组织中ICAM-1/LFA-1的表达，并用共聚焦显微镜检测二者的表达和关系，为探讨胚胎植入和流产发生的机制及防治自然流产提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

①流产组(SA组)：选择在2009年9月至2010年4月之间在西安交通大学医学院第一附属医院及西安医学院附属医院妇产科门诊和病房就诊停经7～10周，出现阴道流血或/和下腹部疼痛，通过详细的询问病史与系统检查，并经妇科及B超检查确诊为宫内孕，排除其他原因所致阴道流血及腹痛，诊断为自然流产的患者33例，年龄为24～38岁，平均年龄29.6±3.2岁，孕期为49～70天，平均孕期58.7±5.9天；②对照组：选择同期妊娠，无异常孕产史，停经7～10周并行人工流产术的健康妇女30例，本次妊娠经过无异常，并经B超提示胚胎发育正常，年龄为23～39岁，平均年龄28.1±3.4岁，孕期为49～70，平均孕期57.8±5.9天。两组年龄及孕期比较差异均无统计学意义(t=1.154，P>0.05；t=0.327，P>0.05)。

1.2 主要试剂

鼠抗人ICAM-1抗体、兔抗人LFA-1抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；S-P免疫组化染色试剂盒购自美国ZYMED公司；Cy5标记的羊抗鼠抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔抗体购自美国Southern Biotech公司。

1.3 方法

1.3.1 标本采集

清宫或人工流产手术后取得绒毛和蜕膜组织立刻浸入生理盐水中，漂洗干净后滤纸沾干，置入40g/L多聚甲醛中固定2～6小时后，将组织置250g/L蔗糖溶液中过夜，沉底后-70℃中冻存。将制备好的组织标本于恒冷箱冰冻切片机上进行切片，厚度为10μm两张(10μm是平均的细胞直径，共聚焦显微镜检测用)和5μm(免疫组化用)两张，吹干后置-20℃冰冻待用。

1.3.2 免疫组化染色

采用免疫组化S-P法对实验标本分批染色，按试剂盒说明书进行操作。磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Saline，PBS)代替一抗为阴性对照。经二氨基联苯胺(3,3'-diaminobenzidine，DAB)显色，苏木素复染后封片，于48小时内光镜下阅片。先在低倍视野下(×200)选取细胞分布均匀的视野，再在高倍镜下(×400)使用Q55OCW采集图像，image-plus分析软件对ICAM-1、LFA-1蛋白的染色强度进行半定量分析，进行光密度(optical delnsity，OD)缩写的测定。每张切片的每类组织在高倍镜下任取5个视野进行光密度值分析，计算其平均光密度值作为其染色强度。

1.3.3 共聚焦显微镜检测

取切片厚度为10μm的冰冻切片正常山羊血清封闭，加1:100稀释的鼠抗人ICAM-1抗体，37℃2小时；PBS(pH7.4)洗涤后滴加Cy5标记的羊抗鼠抗体，37℃30分钟；PBS(pH7.4)洗涤后滴加1:100稀释的兔抗人LFA-1抗体，PBS(pH7.4)洗涤后滴加异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate，FITC)标记的羊抗兔抗体，37℃30分钟，PBS洗涤后甘油缓冲封片，置于激光共聚焦扫描显微镜(奥林巴斯 FluoView FV1000)下观察。用于FITC的激发波长为488nm，发射波长为535nm，激发出的荧光为绿色，用于Cy5的激发波长为543nm，发射波长为700nm，激发出的荧光为鲜红色。若两种待测物分布于细胞的同一位点，则可产生红、绿两种颜色的重叠色黄色。

1.4 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，计数资料用χ2或Fisher精确概率法、两独立样本的非参数Mann-Whitney测试进行比较；两组间均数比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组蜕膜组织中细胞间黏附分子-1表达强度的比较

流产组蜕膜基质细胞ICAM-1表达强度明显高于对照组(P=0.001<0.05)；流产组蜕膜腺体细胞ICAM-1表达强度明显低于对照组(P=0.013<0.05)；血管内皮细胞ICAM-1表达强度两组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、图1。

注：A为早期自然流产患者蜕膜组织 B为正常早孕妇女蜕膜组织ICAM-1的表达S-P(×400) ICAM-1的 表达S-P(×400)

图1 早期自然产患者(A)和正常早期妊娠(B)蜕膜组织中ICAM-1的表达

Fig.1 Expressions of ICAM-1 in decidual tissues of women with early spontaneous abortion (A) and normal pregnant women (B)

2.2 两组蜕膜组织中淋巴细胞功能相关抗原-1表达强度的比较

流产组蜕膜基质细胞LFA-1表达强度高于对照组(P=0.001<0.05)；流产组蜕膜腺体细胞LFA-1表达强度明显低于对照组(P=0.027<0.05)；血管内皮细胞LFA-1表达强度两组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2、图2。

注：A为早期自然流产患者蜕膜组织 B为正常早孕妇女蜕膜组织ICAM-1的表达S-P(×400) ICAM-1的 表达S-P(×400)

图2 早期自然流产患者(A)和正常早期妊娠(B)蜕膜组织中LFA-1表达

Fig.2 Expressions of LFA-1 in decidual tissues of women with early spontaneous abortion (A) and normal pregnant women (B)

2.3 蜕膜组织中细胞间黏附分子-1和淋巴细胞功能相关抗原-1的荧光双标共聚焦检测情况

激光共聚焦显微镜下观察显示，早期自然流产和正常早期妊娠的蜕膜组织细胞均有不同程度的ICAM-1(红色)和LFA-1(绿色)表达。ICAM-1和LFA-1的表达主要位于细胞膜，部分位于细胞基质，其阳性表达呈片状、灶状或单个弥散分布，弥漫着色。蜕膜组织的基质细胞、腺体细胞和血管内皮细胞均有大部分重合区域呈黄色表达。

两组中蜕膜基质细胞二者基本重合呈黄色；流产组腺体细胞基本重合呈黄色，但对照组LFA-1表达强度明显比ICAM-1强，呈现绿色表达，见图3。

图3 早期自然流产患者(A)和正常早期妊娠(B)蜕膜组织中ICAM-1、LFA-1的表达(×400)

Fig.3 Expressions of ICAM-1 and LFA-1 in decidual tissues of women with early spontaneous abortion(A)and normal early pregnant women(B)(×400)

3 讨论

3.1 细胞间黏附因子-1和淋巴细胞功能相关抗原-1与妊娠的关系

生理妊娠类似于同种异体移植，在胚泡定位、黏着和穿透过程中，涉及激素、细胞因子、黏附分子之间的协同作用。ICAM-1作为黏附分子的一员，存在于许多细胞的表面和细胞基质，包括子宫内膜上皮和间质细胞、血管内皮细胞和白细胞等，主要介导细胞与细胞间的黏附，其一方面介导细胞毒和炎症反应，另一方面发挥免疫作用，与配体LFA-1、Mac-1结合，启动细胞黏附和活化，传递细胞间信息，参与免疫应答，炎症发生[3]，胚胎发育[4]，心血管疾病[5]，恶性肿瘤转移[6]等一系列生理及病理过程。Burrows(1994年)研究发现，ICAM-1 mRNA在孕早期蜕膜和绒毛膜的血管内皮细胞上都有表达。Peter(1994年)的组化实验亦显示，早孕人蜕膜淋巴细胞有大量ICAM-1表达。Defrere(2005年)研究发现体外培养子宫内膜上皮细胞表达ICAM-1比基质细胞强。Blois(2005年)、Tamblyn等[4]研究认为小鼠母胎界面ICAM-1/LFA-1结合可以引起炎性因子集聚导致流产，阻断ICAM-1/LFA-1母胎界面免疫耐受性的恢复。有研究发现，ICAM-1在子痫前期患者胎盘可溶性ICAM-1表达降低[7]，但是在胎盘绒毛炎表达增高[3,8]，说明ICAM-1在母胎界面的表达与妊娠的结局是有关系的。

3.2 细胞间黏附因子-1和淋巴细胞功能相关抗原-1在早期自然流产蜕膜组织的表达

蜕膜是由多种细胞成分组成，蜕膜细胞及其分泌的细胞因子构成了蜕膜免疫微环境中特殊的细胞因子网络，在保护胎儿生长发育，免受母体的免疫排斥中起着重要的作用。Blois(2005年)研究表明，有流产趋向的鼠子宫内膜和基质细胞中发现ICAM-1高表达，与本研究发现相似，即早期自然流产患者蜕膜组织的ICAM-1、LFA-1蛋白表达强度在基质细胞高于正常早孕妇女。自然流产妇女蜕膜中Th1因子干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α等增加，可以激活核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和增殖作用蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路，从而上调内皮ICAM-1和LFA-1表达，介导静息淋巴细胞的活化及白细胞与内皮细胞的黏附和游走，不利于胚胎着床[9-10]。本研究亦发现早期自然流产患者蜕膜组织中的ICAM-1、LFA-1在腺体细胞的表达均低于正常早孕妇女，说明了蜕膜腺体细胞生理水平的ICAM-1/LFA-1结合，在妊娠早期发挥着重要作用。

本研究发现ICAM-1和LFA-1在流产组和对照组蜕膜组织的基质细胞、腺体细胞和血管内皮细胞均有大部分重叠表达，但还有小部分不能重合，说明ICAM-1主要和受体LFA-1结合，除此之外，还存在其他受体结合途径。但可以看出流产组腺体细胞ICAM-1/LFA-1基本重合，而对照组ICAM-1表达相对较弱，说明在流产妇女蜕膜腺体存在着异常的ICAM-1/LFA-1结合升高，具体机制还有待进一步研究。

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[专业责任编辑：张欣文]

Expressions of ICAM-1 and LFA-1 in decidual tissues of patients with early spontaneous abortion

WANG Li-qin1, YAN Xiao-ting2, YU Xue-wen3, CHU Jing1, LI Jing1, LI Teng1

(1.DepartmentofNursing,Xi’anMedicalCollege,ShaanxiXi’an710021,China;2.MedicalSchoolinXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061,China;3.FirstAffiliatedHospitalofMedicalSchoolinXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061,China)

Objective To explore the correlation of intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) with early spontaneous abortion by observing the expressions of them in decidual tissues of patients with early spontaneous abortion. Methods The ICAM-1 and LFA-1 expressions in the decidual tissues of 33 women with early spontaneous abortion and 30 normal pregnant women were analyzed by S-P immunohistochemistry method, and the relationship between ICAM-1 and LFA-1 was detected by confocal laser scanning microscope (CLSM). Results In abortion group the expressive intensity of ICAM-1 and LFA-1 was significantly stronger in the decidual stromal cells (t=-3.632，P=0.001；t=-3.839，P=0.001) and weaker in the decidual glandular epithelial cells than in the control group (t=-2.613，P=0.013；t=-2.266，P=0.027). The ICAM-1 and LFA-1 expression in the decidual tissues overlapped under CLSM，and the overlapped expression of decidual glandular epithelial cells in abortion group was more obvious than in control group. Conclusion High expressions of ICAM-1 and LFA-1 in decidual stromal cells and low expressions of them in decidual glandular epithelial cells may be correlated with the occurrence of early spontaneous abortion.

early spontaneous abortion；intracellular adhesion molecule-1(ICAM-1)；lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1)；immunohistochemistry；confocal laser scanning microscope (CLSM)；decidua

2014-12-17

国家自然科学基金资助项目(No.81270697)；陕西省教育厅科研计划资助项目(11jk0713)

王立芹(1974-)，女，副教授，硕士，主要从事优生遗传的临床研究。

于学文，教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.05.003

R714.21

A

1673-5293(2015)05-0917-03