锦鲤疱疹病毒病简述

段宏安，周 毅 ，徐 晔，姚燕林，丁 超，曹 洁，范广宇，孟祥龙

（连云港出入境检验检疫局，江苏连云港 222042）

锦鲤疱疹病毒病简述

段宏安，周 毅 ，徐 晔，姚燕林，丁 超，曹 洁，范广宇，孟祥龙

（连云港出入境检验检疫局，江苏连云港 222042）

锦鲤疱疹病毒病是一种危害严重，尚无有效治疗方法的高致病性传染病。本文汇集大量科研成果，从病原学、流行病学、病理学三个角度对该病毒的特性进行简述，在此基础上，推荐了实验室检测技术，提出了防控建议。

锦鲤疱疹病毒病；KHV；病原学；流行病学；病理学；预防与控制；检测技术

锦鲤疱疹病毒病（Koi herpesvirus disease，KHVD）是由锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）感染鲤鱼及锦鲤等变种而引起的一种高致病性急性传染病。以色列和德国于1998年首次报道KHVD，英国1996年从大量死亡鲤鱼组织样本中检测出KHV DNA，目前该病在世界范围内流行。其危害已引起世界动物卫生组织（OIE）和联合国粮农组织（FAO）的高度关注。

1 病原学

1.1 分类

病原为异样疱疹病毒科鲤疱疹病毒属鲤疱疹病毒3型（CyHV-3）[1-2]，曾称为鲤间质性肾炎和鳃坏死病毒（CNGV）[3]，同属还有鲤疱疹病毒1型（CyHV-1，鲤痘病毒、鱼乳头状瘤病毒）和2型（CyHV-2，金鱼造血器官坏死病毒）。KHV与CyHV-1和CyHV-2病毒部分基因组的序列密切相关，与斑点叉尾鮰病毒（IcHV-1）和蛙疱疹病毒（RaHV-1）距离较远[4]。

Aoki等[5]研究发现来自以色列、美国和日本的三株病毒在基因水平上高度相似，三株中以色列和美国株的关系更密切，这三株病毒可能来源于同一野生父本的2个谱系（J -日本谱系、U/I-以色列/美国谱系）。Kurita等[6]推测2个谱系存在遗传差异，分别称为欧洲（包括U和I基因型）和亚洲谱系（包括J基因型），欧洲谱系有7个变异型E1至E7，亚洲谱系只有2个变异型A1和A2[6]。对法国、荷兰和波兰KHV样品研究发现，还存在第三谱系，据推测是随锦鲤引入欧洲的[7]。印度尼西亚发现可能还有一个谱系[8]。

1.2 生物学特性

KHV具有典型的二十面体结构，核衣壳直径为100～110nm[3]，外被含病毒蛋白的脂质囊膜，以及位于核衣壳与囊膜间的无定形蛋白层。病毒颗粒直径167～200nm。

1.3 基因组结构和功能

该病毒为线形双股DNA病毒，基因组大小295kb[3]。DNA分子包括一个大的中央区及两个22kb、分布在二端的重复区[9]。据推测病毒基因组含有156个开放性阅读框（ORF），其中8个（ORF1～8）为末端重复序列，9个ORF具有内含子。目前KHV大多数ORF未确定功能。Michel等[10]研究鉴定40种结构蛋白，其中3种编码衣壳蛋白、13种为囊膜蛋白、2种为皮层蛋白、22种是未定性的结构蛋白。ORF81是研究较清楚者之一，编码3型膜蛋白，位于病毒囊膜上。其表达产物据认为是KHV最具免疫原性的膜蛋白之一。

1.4 病毒抵抗力

KHV在22℃池塘水中可存活4h，在粪便和池塘淤泥中可能存活较长时间。病毒在60℃30 min或 35℃ 2d、pH低于3或高于11的条件下失活。并且易被氯仿、25%乙醚或0.1%的Triton X-100灭活[11-12]。病毒经紫外线照射和50℃以上1min灭活。在15℃时，下列消毒剂作用可灭活病毒：200mg/L碘伏20min，60mg/L苯扎氯铵 20min，30%乙醇20min，次氯酸钠200 mg/L 30s[13]。

2 流行病学

2.1 历史及地理分布

以色列和德国于1998年首次报道KHVD，目前该病毒已传播至奥地利、比利时、丹麦、法国、意大利、卢森堡、荷兰、波兰、瑞典、英国、中国香港、中国台湾、印度尼西亚、日本、韩国、马来西亚、新加坡和泰国。南非、加拿大和美国也曾报道过发生KHVD。据此推断，可能有更多的国家或地区存在KHV。

2.2 易感动物

KHV传染性和毒力极强，宿主范围小，仅感染鲤鱼、锦鲤及其普通变种。一些杂交品种也可感染KHV[12]。所有阶段的鱼体都可能感染KHV。死亡率与养殖密度有关，网箱养殖死亡率为50%～80% ，最高可达100%。

2.3 季节性

该病主要受水温影响，易发水温为18℃～28℃，23℃～28℃容易引起暴发流行。鱼可在较低水温下感染但不表现临床症状，恢复到容许水温时则呈现典型的疾病特征和发生死亡现象[12]。

2.4 传播方式和传染源

KHV主要依靠水平传播，但目前也不能排除垂直传播[13]。KHVD 传染源是临床感染鱼或养殖、野生鱼中潜藏的病毒携带者，病毒通过粪便、尿液、鳃和皮肤粘液排出体外。

该病可通过接触病鱼，或者是被污染了的水体、底泥等传播[12]。鳃坏死是该病的主要症状之一，在发病早期的鳃组织中就可检测到病毒DNA。另有研究表明，鲤鱼的皮肤是KHV的主要侵入途径。KHV侵入鱼体后，在肾脏中大量增殖[14]。

水温是决定锦鲤疱疹病毒病发病的主要原因，23℃～25℃下病程发展迅速，但在低于23℃时病程稍慢。水温不适宜时，易感品种感染病毒但不发病，与KHV暴发后幸存的鱼共同成为疾病的传播者。

3 病理学

3.1 临床症状

发病鱼离群、嗜睡，聚集在入水口或池塘边，浮在水面大口呼吸。一些鱼可能身体失衡，无方向感。有些鱼可能躁动不安，然后是不活跃期。皮肤苍白或发红，或质地粗糙（砂纸样），局部或全部上皮脱落，皮肤或鳃粘液分泌过度或不足，鳃苍白。皮肤和鳍根部出血，以及鳍条糜烂[13]。鱼眼凹陷，类似寄生虫感染和细菌感染；出现症状后24～48h后开始死亡，至2～4d内死亡率可迅速达80%～100%[11]

3.2 病理变化及发病机理

感染KHV后病鱼最明显的损伤是鳃、肾脏、肝脏和脾脏。鳃丝变为深红色，鳃片减少，鳃结构消失，鳃弓内血管充血。病变以肾脏为重，肾脏充血、出血；肾小管周围出现炎性浸润、间质性炎症。管状上皮细

胞轻微变性。肝胰脏肿大，呈灰白色；肝实质炎性浸润或出血。脾脏变紫红色，出血；肠道充血，肠系膜出血；局灶性脑膜和脑膜旁炎症[12，15]。据认为KHV发病机理是：病毒通过鳃进入鱼体后，在鳃或在肾脏大量增殖，上皮细胞坏死脱落，释入水中的病毒再次感染健康鲤鱼或锦鲤。

4 实验室检测技术

4.1 样品采集

《OIE水生动物疫病诊断手册》推荐优先采集出现临床症状的垂死或新近死亡鱼[13]，将活鱼或在无菌密封容器中单独包装的死鱼尽快送到实验室检测，立即取内脏样品。整条鱼或内脏应用冷藏容器或置于冰上快速送往实验室，避免冷冻。冷冻鱼或内脏、以及保存在80%～100%乙醇中的少量组织样品，只适合于PCR等检测方法。当用PCR方法检测临床感染鱼，特别是进行病毒分离时，应避免混样，或最多2条鱼混合为一个样品。用PCR方法对临床健康鱼监测时，最多每5条鱼混合为一个样品。

当用PCR方法检测临床感染鱼，特别是进行病毒分离时，建议采集鳃、肾和脾组织。当用PCR检测亚临床、外表健康鱼，建议同时采集小肠（肠道）和脑。

4.2 病原检测方法

4.2.1 细胞培养分离技术

OIE推荐的敏感细胞系目前有KF和CCB（锦鲤鳍条细胞系和鲤鱼脑细胞系），组织病料接种KF或CCB后置于20℃～22℃培养14天，连传2代。有报道5～7d后出现细胞病变，但有学者认为KF对KHV不敏感。这两种细胞系获取较为困难。另外，细胞培养技术并不像PCR方法敏感，因此认为细胞培养分离病毒并不是一种可靠的KHVD诊断方法。朱霞等[16-17]在国内首次利用细胞培养技术分离到KHV，我国其他学者尝试建立鲤鱼或锦鲤原代或传代细胞培养增殖KHV取得了成功。

4.2.2 分子生物学方法

4.2.2.1 聚合酶链式反应（PCR）

PCR是目前检测KHV感染的较为常用且精确的方法。Gilad等[18]建立了区别KHV、CyHVIcHV-1的PCR方法。Ishioka T等[19]研究发现日本的分离株和他国毒株有相近关系。OIE[13]推荐的方法可以检测亚临床状况的KHV病毒，使用2对引物，第1对是TK引物，第2对是经过改进的。Gilad等[20]建立了TaqMan实时PCR检测KHV。

刘荭等[21]建立了nested- PCR方法，初步证实了2002年广东进口锦鲤暴发病的病原为KHV。乌日琴等[22]研究发现异硫氰酸胍抽提法、PQDS和PQDV引物对检测KHV效果好。范万红等[23]建立了KHV实时荧光定量PCR检测方法.段宏安等[24-25]用2对引物对锦鲤KHV病例进行了PCR+酶切检测鉴定。还有一些中国学者建立了三种基因、荧光定量PCR等方法检测KHV DNA。

PCR方法容易在已经发病鱼样品中检测出KHV阳性，对外表健康鱼较难检测出阳性，也就是无法检测潜伏感染或携带者体内病毒，很容易出现假阴性，操作不当还可出现假阳性。

4.2.2.2 环介导等温扩增技术（LAMP）

Gunimaladevi I等[26]和Soliman H等[27]建立了LAMP法，可在90min内判定结果，并在产物中加入SYBR Green I，根据颜色变化判定结果。

除了上述方法外还有ELISA、电镜及原位杂交技术等。刘亭岐[28]建立了检测KHV抗体的间接ELISA方法。

5 预防和控制

到目前为止，对该病尚无切实有效的治疗方法。以色列的科学家将KHV在KF细胞连续传代，最终获得了致病力很弱的KHV毒株，对KHV产生一定的抵抗力。攻克治疗难关，研制安全有效的疫苗是未来发展的方向。

目前，应采用综合防制措施防控KHVD。加强饲养管理，改善和优化养殖环境；提高养殖种群和养殖群体的免疫力。加强产地检疫，不从疫区引进苗种。要求外来鱼同本地鱼隔离养殖，水体、器具也不应混用。对新引进的鱼至少隔离30d。最好是了解鲤鱼供货方情况，在买鱼时询问他们是否有不明病因的病害损失，是否通过实验室检测KHV

病毒。在参加锦鲤鉴评大赛（展会）时，不要把不同来源的鱼放在一起进行品评；参赛（展）鱼回场后要隔离检疫至少三周。回场或新引进锦鲤在隔离时，放几条本地锦鲤进去，看是否有发病，以此判断是否会产生交叉感染。对已发病的池塘或地区首先进行封锁，禁止向外转移动物和器具，不外排池水。工具未经消毒不在其它池使用。饲养人员要勤于清除发病死亡尸体，及时掩埋、销毁。对发病鱼类及时做出诊断，确立对策指导疾病防治和控制疫情流行。对锦鲤、鲤鱼或观赏鱼进行流行病学调查，对有疑似病例的养殖场要按照规定实施隔离监管并做好防疫消毒工作，对确诊病例要进行深埋或销毁等无害化处理措施。

[1] Haramoto E，Kitajima M，Katayama H，et al. Detection of koi herpesvirus DNA in river water in Japan[J]. J Fish Dis，2007，30：59-61.

[2] Waltzek T B，Kelly G O，Alfaro M E，et al. Phylogenetic relationships in the family Alloherpesviridae[J]. Dis Aquat Org，2009，84（3）：179-194.

[3] Ilouze M，Davidovich M，Diamant A，et al. The outbreak of carp disease caused by CyHV-3 as a model for new emerging viral diseases in aquaculture：a review[J]. Ecol Res，2011，26（5）：885-892.

[4] Waltzek T B，Kelley G O，Stone D M，et al. Koi herpesvirus represents a third cyprinid herpesvirus（CyHV-3）in the family Herpesviridae[J]. J GenVirol，2005，86：1659-1667.

[5] Aoki T，Hirono I，Kurokawa K，et al. Genome sequences of three koi herpesvirus isolates representing the expanding distribution of an emerging disease threatening koi and common carp worldwide[ J]. Virol，2007，81（10）：5058-5065.

[6] Kurita J，Yuasa K，Ito T，et al. Molecular epidemiology of koi herpesvirus[J]. Fish Pathology，2009，44（2）：59-66.

[7] Bigarre L，Baud M，Cabon J，et al. Differentiation between Cyprinid herpesvirus type-3 lineages using duplex PCR[J]. J Virol Methods ，2009，158：51-57.

[8] Sunarto A，Mccoll K A，Crane M S，et al. Isolation and characterization of koi herpesvirus（KHV）from Indonesia：identification of a new genetic lineage[J]. J Fish Dis，2011，34（2）：87-101.

[9] Rakus K，Ouyang P，Boutier M，et al.Cyprinid herpesvirus 3：an interesting virus for applied and fundamental research[J]. Vet Res. 2013，27：44-85.

[10] Michel B，Leroy B，Stalin Raj V，et al.The genome of cyprinid herpesvirus 3 encodes 40 proteins incorporated in mature virions[J]. J Gen Virol，2010，91（2）：452-462.

[11] Ilouze M，Dishon A，Kotler M. Characterization of a novel virus causing a lethal disease in carp and koi[J]. Microbiol Mol Biol Rev，2006，70（1）：147-156.

[12]朱霞，王好，李新伟，等.锦鲤疱疹病毒病的研究进展[J].中国兽医科学，2011（1）：106-110.

[13] OIE.Chapter 2.3.6.Koi herpesvirus disease. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals 2014.http：//www.oie. int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/aahm/current/2.3.06_ KHVD.pdf，2014.

[14] Hedrick R R，Gilad O，Yun S，et al. A herpesvirus associate with mass mortality of juvenile and adult koi，a strain of a common carp[J]. J Aquat Anim. Health，2000，12：44-57.

[15] Kielpinski M，Kempter J，Panicz R，et al.Detection of KHV in freshwater mussels and crustaceans from ponds with KHV history in common carp（Cyprinus carpio）[J]. Isr J Aquacult Bamid，2010，62（1）：28-37.

[16]朱霞，李新伟，王好，等.一株锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定[J].中国预防兽医学报，2011（5）：340-343.

[17]朱霞.框镜鲤原代细胞培养和锦鲤疱疹病毒的分离鉴定[D].吉林：吉林农业大学，2011.

[18] Gilad O，Yun S，Adkison M A，et al. Molecular comparison of isolates of an emerging fish pathogen，koi herpesvirus，and the effect of water temperature on mortality of experimentally infected koi[J]. J Gen Virol，2003，84：2661-2667.

[19] Ishioka T，Yoshizumi M，Izumi S，et al. Detection and sequence analysis of DNA polymerase and major envelope protein genes in koi herpesviruses derived from Cyprinus carpio in Gunma prefecture，Japan[J].Vet Microbiol，2005，110（1/ 2）：27-33.

[20]Gilad O，Yun S，Francisco J，et al．Concentrations of a Koi herpesvirus（ KHV）in tissues of experimentally infected Cyprinus carpio koi as assessed by real-time TaqMan PCR[J]. Diseases of aquatic organisms，2004，60（3）：179-187．

[21]刘荭，史秀杰，高隆英，等.进口锦鲤暴发病病原的nested-PCR鉴定[J].华中农业大学学报，2002（5）：414-418.

[22]乌日琴，刘中勇，黄宝春.PCR方法快速检测锦鲤疱疹病毒基因[J].检验检疫科学，2005（2）：6-8.

[23]范万红，刘荭，岳志芹，等.锦鲤疱疹病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J].中国海洋大学学报（自然科学版），2007（5）：785-788，722.

[24]段宏安，张睿，徐晔，等.锦鲤疱疹病毒PCR检测鉴定初报[C]//中国微生物学会.2006中国微生物学会第九次全国会员代表大会暨学术年会论文摘要集.北京：中国微生物学会，2006：1.

[25]段宏安，张睿，徐晔，等. 锦鲤疱疹病毒的PCR鉴定[J].畜牧与兽医，2008（11）：78-80.

[26] Gunimaladevi I，Kono T，Venugopal M N，et al.Detection of koi herpesvirus in common carp，Cyprinus carpioL by loop mediated isothermal amplification[J]．J Fish Dis，2004，27（10）：583-589．

[27]Soliman H，El-Matboull M．An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus（ KHV）infection by loop mediated isothermal amplification[J]. Virol J，2005，2：83．

[28]刘亭岐.锦鲤疱疹病毒抗体血清学检测方法的建立及应用[D].南京：南京农业大学，2012.

Koi Herpesvirus Disease

Duan Hongan ，Zhou Yi，Xu Ye，Yao Yanlin，Ding Chao，Cao Jie，Fan Guangyu，Meng Xianglong
（Lianyungang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of P.R.China，Lianyungang，Jiangsu 222042）

Koi herpesvirus disease（KHVD）is a serious and highly infectious disease and there is still no effective treatment for it at home and abroad. In the paper，the characteristics of the virus were described based on research findings from its etiology，epidemiology and pathology. Laboratory test techniques were recommended and prevention and control measures were proposed.

Koi herpes virus；KHV；etiology；pathology；epidemiology；prevention and control；laboratory technology

S943

A

1005-944X（2015）06-0048-05

质检公益项目201310221