基因条形码技术在鱼类物种识别与鉴定中的应用

高 峰，于伯华，王丽娟，杨瑞章，沈山江，秦志军

（盐城出入境检验检疫局，江苏盐城 224002）

基因条形码技术在鱼类物种识别与鉴定中的应用

高 峰，于伯华，王丽娟，杨瑞章，沈山江，秦志军

（盐城出入境检验检疫局，江苏盐城 224002）

食品安全关乎国计民生，随着食品的掺假方式越来越多，水产品真伪鉴别也愈发引起关注。本文主要介绍目前水产品的鉴定方法，以及用于水产品鉴定的各种目的基因的选择。回顾DNA条形码技术在国内外水产品掺假鉴定中的重要应用，使其有望实践中得到推广应用。

DNA条形码技术；水产品；掺假；鉴定；食品安全

伴随着食品工业的飞速发展，食品的掺假方式越来越多，范围越来越广，内容越来越复杂。掺假的方式包括掺兑、混入、抽取、假冒等。掺假范围涉及粮油、肉类和肉制品、乳制品、果蔬等[1]。目前，国际市场上在水产品的生产与销售中，利用掺杂掺假、以次充好等手段欺骗买家，谋取暴利的事件屡屡发生。斑点叉尾鮰鱼由于具有生长快、适温范围广、抗病力强、肉嫩味美、易于加工（无肌间刺）等特点，一直深受养殖者、加工企业和国内外消费者的欢迎。在我国斑点叉尾鮰鱼大量出口美国的同时，越南瞄准美国冷冻鲶鱼片市场，大量的越南鲶鱼（巴沙鱼）在加工后借道中国，打上中国斑点叉尾鮰的标签进入美国市场。越南鲶鱼借道中国进入美国市场，一方面损坏中国斑点叉尾鮰的国际品牌信誉，影响我国正宗斑点叉尾鮰鱼产品的出口；另一方面这些冒牌的越南鲶鱼压低了我国斑点叉尾鮰鱼的出口价格，损害经营者的利益。为了维护我国渔民的正常权益，保护我们国内的市场，保证我国在国际市场的正当地位和竞争优势，对出口水产品进行掺假掺杂检验就显得非常必要。因此，开发新型快速的鉴别方法显得十分必要，其重点是快速、准确地鉴定水产品的品种来源。而要达到上述目的需分子生物学方法的协助，随着生物技术的发展，以物种间基因差异为基础的分子生物学鉴定方法成为研究的热点，这就需要我们对检测物品的生物大分子特性做出深入了解和认识。目前主要有以核酸和蛋白为基础的鉴定方法，而以核酸为基础的鉴定方法已成为水产品品种鉴别最常用的方法。这其中尤以基因条形码最具有代表性，是目前适合我们在水产品中进一步推广和研究的技术鉴定手段。

1 出口水产品品种的鉴定方法

动物品种的鉴定方法主要从蛋白和核酸两个层次进行。以蛋白为基础的鉴定方法主要包括十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE）等电聚焦电泳和免疫学方法[2]。以核酸为基础的鉴

定方法包括物种特异引物多重PCR、荧光PCR、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（ PCRRFLP）等[3]。相应的，分析水产品品种的方法也主要有两种，即蛋白质鉴定（等电聚焦电泳、酶联免疫吸附试验、色谱等）和分子生物学鉴定（DNA分子杂交、PCR方法等）。蛋白质鉴定技术已成功用于鉴别生鲜肉类的品种，但当水产品经过切碎、混合、蒸煮等加工烹调过程后，失去了原有的形态学特征和质地，加工处理也会改变其蛋白质的结构和稳定性，从而破坏物种特有的蛋白质或抗原决定部位，所以，蛋白质鉴定技术鉴定水产品品种的稳定性和可靠性较差，已不能满足水产品检测的要求。随着生物技术的发展，以物种间基因差异为基础的分子生物学鉴定方法成为研究的热点。主要原因是 ：分子生物学鉴定方法不依赖于组织和细胞的类型，且DNA比蛋白质的耐热性强，即便高温处理过的水产品中仍能提取出小片段的 DNA。由于不同的基因片段进化效率不同，可以根据实验目的，选择不同的目的基因进行研究。此外，DNA比蛋白质具有更高的种间多态性，更有利于品种鉴定[4]。由于分子生物学鉴定中的DNA杂交法费时、昂贵且复杂，而PCR方法由于反应时间短，具有较高灵敏性、特异性和可鉴别性，已成为水产品品种鉴别最常用的方法。

2 PCR 技术鉴定出口水产品品种基因的选择

利用PCR法对物种鉴定的关键因素是选择合适的分析基因。2002年，DNA条码技术（DNA barcoding）首次被提出来，并在多个物种鉴定中成功应用，为研究和利用地球上众多的生物资源、鉴定生物多样性提供了强大的工具[5]。基因条形码以传统的DNA序列标记技术为基础，其在概念上与基因分型类似，并与系统发育和分类学研究有一定的关联。简单来说，即通过对一组来自不同生物个体的短的同源DNA序列（约800bp）进行PCR扩增和测序，随后对测得的序列进行多重序列比对和聚类分析，从而将某个体精确定位到一个已描述过的分类群中［6］。对某些物种来说，甚至还具有足够的结构特征可将其定位到特定的地理种群。基因条形码工作可以建立在一段长度为几百个碱基的基因序列信息的基础之上，从理论上来讲完全可以包括所有物种［7］。

目前，被广泛用于系统发育研究标志基因的核糖体12S和16S基因，因存在大量的插入和缺失现象，不宜用作条形编码基因［8］。而线粒体中存在的13个蛋白编码基因却很少存在插入和缺失，在这13个候选基因中，综合基因序列的长度和进化速率两个条件，最终选定了线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（mtCOI）中一段约645个碱基长度的片段作为条形编码基因［9］。此外，线粒体细胞色素b基因（Cytb）是构成线粒体氧化磷酸化系统复合体Ⅲ的蛋白质之一，也是其中唯一由线粒体基因组编码的蛋白质。由于Cytb基因遵循严格的母系遗传，并在线粒体基因组中进化速度适中，较短的l个DNA片段就能包含从种属水平到属水平乃至纲水平的系统发育信息，因而线粒体Cytb基因成为研究分子系统进化的理想材料，在研究鱼类如鲷鱼、蓝鳃太阳鱼、花斑裸鲤、条纹斑竹鲨等的遗传多样性和系统发生等方面有着广泛的应用［10］。

3 国外研究进展

20世纪80年代，国外开始对水产品物种溯源进行研究，初期的研究对象主要是一些淡水鱼类，采用的方法主要有DNA杂交、免疫扩散和等电点聚焦［11］等。这些方法大都成本高，工作量大，对检测对象要求高。因此，建立一种快速、灵敏、特异性强的检测水产品品种的方法一直是研究的热点。随着PCR技术的不断发展和完善，PCR方法已成为国外鉴别水产品物种最成熟的方法。Yancy等[12]对基于线粒体COI基因的DNA条码技术进行了研究，利用DNA条码技术方法简单，可快速准确地鉴定单个物种，也能可靠有效地发现隐藏物种的特性。研究表明，物种鉴定DNA条码技术具有广阔的应用潜力。Wong，LL等[13]对基于线粒体COI基因序列的DNA条码在鲶鱼属鱼类物种鉴定中的应用进行了研究，应用COI基因，通过DNA条码技术，可对斑点叉尾鮰鱼进行鉴定。Pereira等[14]应用COI基因，通过DNA条码技

术，可准确对新热带地区的淡水鱼类物种进行鉴定，其中80%的鱼类属于脂鲤目、鲶形目、鲈形目。Bhattacharjee等[15]对基于线粒体COI基因序列的DNA条形码在鲶科鱼类物种鉴定中的应用进行了研究，构建了鱼类物种基因条形码检测技术。Locke等[16]应用线粒体COI基因对加拿大圣劳伦斯河的扁形动物门复殖亚纲的鱼类进行物种鉴定，研究表明，物种鉴定DNA条码技术具有广阔的应用潜力。Pazian等[17]联合应用COI和Cytb基因，通过DNA条码技术对脂鲤目鱼类物种进行了鉴定，研究表明应用COI和Cytb基因对脂鲤目鱼类DNA条形码进行物种鉴定具有一定的可行性。Hanner等[18]联合应用COI和Cytb基因，通过DNA条码技术为主的基因分析方法对中国南海主要鱼类进行物种鉴定。

4 国内的研究进展

国内用 PCR 方法对水产品的掺假、掺杂检验和品种溯源的研究起步较晚，随着我国水产科技工作者的努力，到目前为止已取得了可喜的成果。程磊等[5]研究了线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（COI）基因5’端651 bp的片段在这些种和亚种（共计128尾标本）中的变异。结果表明，黑鲫、白鲫和鲫均为有效种，同时，欧亚大陆与日本列岛的鲫有明显分化；而银鲫和鲫有一些共享的单倍型，银鲫应被视为鲫的一个亚种，而不是一个有效物种。由于鲫和银鲫等类群中同时存在二倍体和三倍体，因此，倍性不宜作为种或亚种的划分标准。田金辉等[11]综述了目前通过分子标记手段检测动物源性成分的常用方法，COI和Cytb基因都拥有适合的长度和慢的进化速率，所以适合作为DNA鉴定系统的目标基因。宁平等[10]应用DNA条形码技术对印度-西太平洋沿岸6种金线鱼属鱼类分类及亲缘关系进行了研究。彭居俐等[19]研究探讨了线粒体COI基因作为DNA条形码对鲌属鱼类进行物种鉴定的可行性，研究中获得了鲌属4种鱼类共32个个体长度为816bp的COI基因序列，利用MEGA软件计算鲌属鱼类种间及种内遗传距离，利用邻接法、最大简约法、最大似然法和Bayesian方法分别构建分子系统树，结果显示，鲌属鱼类的种间遗传距离显著大于种内遗传距离，在系统树中，鲌属鱼类每一物种的个体分别形成各自独立的分支。基于COI基因的DNA条形码在识别鲌属鱼类物种方面和传统形态学基本一致，而且该基因可以探讨鲌属鱼类种间的系统发育关系。该研究表明以COI基因作为鲌属鱼类DNA条形码进行物种鉴定具有一定的可行性。周晓犊等[20]分析了150尾刀鲚、湖鲚、短颌鲚、七丝鲚及凤鲚个体的COI基因DNA条形码序列变异，研究表明COI基因条形码技术可用于我国鲚属物种的鉴定。张凤英等[21]对采自东海的银鲳、翎鲳和中国鲳3种鲳属鱼类的线粒体COI基因序列片段进行扩增和序列测定。柳淑芳等[22]对石首鱼科19属30种鱼类75个COI基因片段的序列比较和系统进化研究，证明线粒体COI基因可作为DNA条形码对石首鱼科鱼类进行有效的物种鉴定。孟玮等[23]以亚东鲑为研究对象，测定分析了线粒体COI基因638bp碱基序列，探讨了该基因作为DNA条形码在鲑科三种鱼类（亚东鲑、大西洋鲑和红点鲑）鉴定方面的可行性和有效性。

5 讨论

虽然蛋白质鉴定技术已成功用于鉴别生鲜肉类品种的检测中，但是当应用于水产品检测时就会出现很多问题。根本原因就在于水产品经过加工烹调过程后，失去了原有的形态学特征和质地，而进一步的加工处理也会改变其蛋白质的结构和稳定性，从而破坏物种特有的蛋白质或抗原决定部位，所以，蛋白质鉴定技术鉴定水产品品种的稳定性和可靠性较差，已不能满足水产品检测的要求。而基因条形码技术则不存在上述局限，并且基因条形码技术在国内外的其他类物品检测中都得到了很好的发展和应用，实践表明该技术应用于水产品的检测是切实可行的，在我们选取合适的基因位点后其准确性和特异性都很好，完全能够满足我们进出口检验检疫的需要。

DNA作为分子标记使用的可行性及其在物种分类和生物进化研究领域的实用价值已为大量的分子系统发育研究所证实，明显提高物种鉴定的效率[24]。序列标记、DNA库和组织库（分类凭证标本）是基因条形码标准化目标实现的3个关键环节。随着大规模测序计划所伴随的海量数据的产生，基因条形码研究在过去以DNA为基础的分类鉴定研究

上又具有了新的内涵。被视为数字化的基因条形码数据库，能提供明确的信息，不仅弥补了形态描述的不足，而且可以加快已知物种的识别速度，同时便于新物种的发现，将会使分类学科的发展更加快速和深入。这无疑对品种繁多、形态各异的水生动物及其产品的分类、鉴定提供有效的研究手段。更为不同水产品的来源溯源提供可靠的检测技术保障。

基因条形码技术快速、简便的操作特点，使其有望在一线口岸得到推广应用，从而为水产品顺利出口提供有力保障，促进外贸业更加健康、顺利发展。

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Application of Genetic Barcode Technology in Recognition and Identifi cation of Fish Species

Gao feng，Yu Bohua，Wang Lijuan，Yang Ruizhang，Shen Shanjiang，Qin Zhijun
（Yancheng Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau，Yancheng，Jiangsu 224002）

Food safety is of vital importance to the national economy and people's livelihood. With more and more food adulterations，the identification of adulterated aquaculture products has aroused much attention. The present identification methods for aquaculture products were introduced in the paper，with selection of target genes used for aquaculture product identification in particular. The applications of DNA barcode technology both at home and abroad were reviewed，hoping the technology to be extended in practice.

DNA barcode；aquaculture product；adulteration；identification；food-safety

S763.3

A

1005-944X（2015）06-0044-04

江苏检验检疫局科研项目（2011KJ43）