环介导等温扩增技术及其在动物疫病检测中的应用

胡 成，成大荣，余树培，赵 方，苏玲玲，蔡树东，顾玲玲，王永娟

（1.扬州大学 兽医学院，江苏扬州 225009；2.江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300）

环介导等温扩增技术及其在动物疫病检测中的应用

胡 成1，成大荣1，余树培1，赵 方1，苏玲玲1，蔡树东1，顾玲玲1，王永娟2

（1.扬州大学 兽医学院，江苏扬州 225009；2.江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300）

环介导等温扩增（LAMP）是一门新兴的分子生物学检测技术，因其具有高特异性、高灵敏度、简便快捷、成本低廉等特点，受到越来越多兽医工作者的关注。目前，该方法已经广泛应用于各种病原微生物的检测。本文就环介导等温扩增技术的原理、方法、应用等方面进行简述，最后指出LAMP当前存在的一些不足之处，并对其发展前景进行了展望，以期为其临床应用提供理论依据。

环介导等温技术；动物疫病；应用；检测

核酸的体外扩增技术是生命科学领域中最常用的研究方法及重要工具之一，自20世纪80年代聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）问世以来，在分子生物学领域、医药卫生领域、医学诊断领域和传染病检测领域得到了广泛的应用[1]。但是，由于核酸的检测过程往往需要昂贵的仪器设备、专业的技能型人才、复杂的操作过程、冗长的实验周期等，不能适应基层及现场的快速检测需要，限制了相关技术的推广应用[2]。

2000年，日本荣研株式会社的Tsugunori Notomi 等人开发了一种新型的核酸等温扩增方法—环介导等温扩增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），利用该技术只需在恒温条件下（60℃～65℃）孵育几十分钟即可快速完成核酸的指数级扩增，无须购置昂贵的PCR仪，操作简单、快速，产物易于检测，特别适用于基层和现场一线的快速检测[3]。短短几年时间，该技术已经在医疗卫生、食品安全、胚胎鉴定、动植

物检验检疫、转基因产品等多个领域的检测中得到了广泛的应用[4]。本文将选取近年来LAMP技术在动物疾病预防控制过程中病原微生物检测方面的应用进行简单综述。

1 技术原理

1.1 扩增基础

环介导等温扩增技术是通过4条特殊的引物对靶基因序列上6个不同区域进行退火杂交，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）提供反应的动力，实现在恒温条件下完成对目的片段的大量扩增，由于规避了常规PCR反应的变性、退火、延伸等一系列复杂的过程，大大节省了反应时间和成本，为临床和现场一线的快速检测提供可能[5]。

1.2 引物设计

环介导等温扩增对引物特异性要求非常高，设计也更为复杂，需要2对引物，即2条外引物（B3/ F3）和2条内引物（FIP/BIP）：外部引物限定了扩增的范围，即目的片段的大小，同时为内部引物提供了模板；内部引物与目的片段部分互补并实现扩增。扩增的目的片段长度最好在300 bp以内，因为随着序列的延长扩增效率随之降低，超过500 bp的序列就很难扩增了。有实验表明，在LAMP反应中加入环引物（LF/LB）能够明显加快扩增的速度，大大缩短检测的时间，检出率也有所提高。

1.3 扩增程序

LAMP的扩增过程包括：循环起始复合物的形成、循环扩增、延伸和再循环4个阶段。呈茎环结构的循环起始复合物是整个LAMP反应中最重要的环节。内引物通过结合到茎环结构环状区域的互补序列上，在Bst DNA聚合酶的作用下合成、延伸并发生置换。如此往复循环，形成一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构及多环花椰菜结构。在反应体系中加入甜菜碱、MgSO4等成分，使得酶活性大大提升，30～60 min即可进行结果判定[6]。

1.4 结果判定

1.4.1 肉眼观察法。LAMP在合成DNA的同时会从dNTPs中析出大量副产物焦磷酸根离子，它们能与反应液中的镁离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，可以通过肉眼直接观察有无乳白色浑浊来判断扩增反应进行与否。有报道指出，扩增结束后，经短暂瞬时离心可使沉淀集中于管底，更加便于观察。

1.4.2 荧光染料法。当反应不彻底导致焦磷酸镁沉淀不足时，往往会对判断造成一定的偏差，产生假阴性或假阳性，可以通过添加适量的荧光染料（如溴化乙啶EB或SYBR Green I）的方法进行辅助观察：它们是高灵敏度的DNA染料，与双链DNA的亲和力非常高，一旦结合其荧光信号会增强800-1 000倍，用来检测扩增是否发生，可确保其准确性。

1.4.3 琼脂糖凝胶电泳法。LAMP最终的产物是若干茎环状DNA片段组成的混合物，即有若干倍茎长度的环结构和类似花椰菜的结构。因此，LAMP扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后于紫外灯下呈现的是典型的梯形条带，而不是只有一条带。

1.4.4 浊度仪检测法。日本荣研株式会社利用LAMP反应过程中产生焦磷酸镁乳白色沉淀在400 nm处有吸收峰的原理，研制出专门用于LAMP检测的实时浊度仪。通过检测沉淀的形成量，对反应中DNA的合成量进行反推，从而对LAMP可进行实时检测和定量[7]。

2 技术特点

2.1 高特异性

针对靶基因序列上6个区域设计的4条顺序相连的特异性引物，任何一处不相匹配均不能进行反应，几乎不可能出现非特异性扩增的情况，因此可以根据是否扩增判断目的基因存在与否，即能够进行病原的定性检测。

2.2 高灵敏性

LAMP的最低检测限至少是传统PCR方法的100倍以上，达到甚至超过real-time Taqman PCR的检测水平，有报道指出最低可检测10个拷贝或更低。

2.3 高效快速

经过优化过的体系，整个扩增反应一般可在

60 min内将靶基因由几个拷贝扩增至109～1010数量级水平，若再引入两条环引物（LF/LB），时间可以进一步缩短1/3～1/2。而传统的PCR方法因为有变复性、升降温的过程，反应一般在90 min以上。

2.4 操作简便

因为反应过程中无须进行变复性温度循环，大大缩短了检测时间，恒温条件下即可进行扩增。所有反应试剂可进行预混并分装冻存，检测时只需加入待检样品，混合均匀，置于水浴锅中孵育一定时间，即可实现快速鉴定。

2.5 一步扩增RNA

只要在原有试剂的基础上加入逆转录酶和RNA酶抑制剂，就能够完全像DNA基因扩增那样，一步实现RNA的扩增，将逆转录过程和扩增过程在同一个反应管中完成[8]。

3 技术应用

3.1 在细菌性疾病检测中的应用

3.1.1 产志贺毒素大肠杆菌的检测。产志贺毒素大肠杆菌（Shinga Toxin-producing Escherichia Coli，STEC）是引起仔猪水肿病的重要病原，由某些血清型溶血性大肠杆菌产生。冯瑜菲[9]等参照GenBank中登陆的基因序列，针对其保守区域（Stx2e基因）使用在线引物设计软件Primer Explorer V4设计了特异性LAMP引物，利用煮沸法提取模板，分别进行PCR和LAMP扩增对比实验。结果显示，LAMP检测模板的最低检测限为3.8×101cfu/管，而PCR方法的最低检测限为3.8×103cfu/管，LAMP方法的灵敏性是PCR方法的100倍。模拟样品的检测结果提示，两者的检出率都是40%，符合率为100%。

3.1.2 布鲁氏菌的检测。布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌（Brucella）引起的一种人畜共患传染病，可引起流产、不孕和各种组织的局部病灶。本病广泛分布于世界各地，家畜中以猪、牛、羊最易发病，给畜牧业和一线兽医工作人员带来严重危害。目前，布鲁氏菌病诊断技术主要有虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）、乳环试验（MRT）、补体结合试验（CFT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、聚合酶链式反应（PCR）等方法。许邹亮[10]等针对布鲁氏菌外膜蛋白OMP25基因保守区设计6条引物，于反应前将羟基萘酚蓝（HNB）染料加入体系中作为LAMP扩增的指示剂，在水浴锅中63 ℃反应60 min即可通过HNB颜色变化进行结果判定。该方法特异性良好，对大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等对照组均未见扩增。针对60份RBT检测阳性血清的平行检测结果显示，LAMP和B4/ B5-PCR这两种方法检测的结果符合率为85.0%。LAMP的最低检测限可达17 fg，敏感性高于B4/ B5-PCR方法100～1 000倍，达到甚至高于荧光定量PCR检测水平。

3.2 在病毒性疾病检测中的应用

3.2.1 DNA病毒的检测

3.2.1.1 猪细小病毒的检测。猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）属于细小病毒科，细小病毒属成员。造成母猪的繁殖障碍并可感染胚胎，导致胎儿死亡、流产。PPV分布广泛，能在外界环境中长期存活并对大部分化学消毒剂不敏感。常规的分子生物学病原检测方法有血清学实验、ELISA、PCR等，但是存在着这样或那样的问题。刘业兵[11]等选用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320型浊度仪对LAMP反应情况进行实时监测，分析反应进程，筛选到可靠、最佳的反应体系，建立针对PPV病原的快速、特异的LAMP检测方法。利用实时浊度仪建立的PPV LAMP反应体系的结果与肉眼可视化判定的结果完全一致，提示其高度的可靠性与稳定性，同时为该技术的临床推广应用提供了理论依据和数据支持。

3.2.1.2 鸭瘟病毒的检测。鸭瘟（Duck plague，DP）是由鸭瘟病毒（Duck plague virus，DPV）引起鸭、鹅等水禽的一种急性败血性传染病，其特征是流行广泛，传播迅速，发病率和死亡率高，严重危害养鸭业的发展。张坤[12]等建立的LAMP检测方法，敏感性可达0.245 μg/L，比普通PCR方法灵敏性高10倍，而且对鸭病毒性肝炎、H9N2亚型禽流感病毒、鸭副粘病毒、鸭源偏肺病毒等常见

病毒的核酸无交叉反应。对40份临床样品的阳性检出率为30%。表明该方法简便快捷，省时省力，是一种适用于基层实验室的快速、准确检测DPV的方法。

3.2.2 RNA病毒的检测

3.2.2.1 猪瘟病毒的检测。猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由黄病毒科，瘟病毒属的猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一种以高传染性和高死亡率为特征的疾病，对养猪业造成极大地损失。常规的检测方法难以区分猪瘟野毒株和疫苗株，张改平[13]等利用一步法RT-PCR的思路，将核酸的逆转录过程与扩增过程相结合，采用RT-LAMP的方法，通过比对野毒株和疫苗株的不同基因，选取NS5B基因上一段差异较大的序列，设计了两组特异性的引物，成功的使用简单快捷的方法将两者进行区分。经测试，该方法灵敏度超出常规RT-PCR 1 000倍以上，且重复性、稳定性良好，为我国猪瘟防控与净化提供了技术支持。

3.2.2.2 新城疫病毒的检测。新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一类主要感染禽类的烈性传染病，是我国重点防控的重大动物疫病。陈兵[14]等选取新城疫病毒融合蛋白基因（F基因）设计了1对特异性的引物，并将目的片段导入pMD18-T Vector成功构建pMD18-T-F重组质粒，并以此为模板进行LAMP反应。在制备反应液时，先将0.5 μL SYBR Green Ⅰ染料小心加入反应管盖内侧，于反应结束后轻轻颠倒反应管数次，以使染料混入，观察颜色变化，可以有效地避免因开盖造成的污染问题。田间样品检测结果显示，20份样品中特异性检出NDV阳性4份，阴性16份，与实时荧光定量RT-PCR检测结果完全一致。

3.3 在支原体疾病检测中的应用

3.3.1 猪肺炎支原体的检测。猪气喘病又称猪支原体肺炎，是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mh）引起的一种慢性接触性呼吸道传染病。支原体可通过空气传播，很难隔离和阻断其传播途径，严重制约养猪业的发展。李鹏[15]等使用Oligo6.71软件设计了4条引物，成功建立了一种快速、简便、可靠的猪肺炎支原体检测方法。优化后的扩增反应条件为60 ℃孵育60 min，最低检测限可达到3个拷贝。对多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、肺炎双球菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和链球菌的检测结果均为阴性，表明该方法特异性良好。与常规PCR方法相比，LAMP法大大缩短了检测时间，且能够特异性鉴别猪肺炎支原体。

3.3.2 鸡滑液支原体的检测。滑液支原体（Mycoplasma synoviae，MS）以侵害鸡关节滑液、腱鞘膜和气囊为主，引起鸡亚临床型的上呼吸道感染和关节滑液囊炎。邓显文[16]等对LAMP和PCR的灵敏度、反应条件和产物检测进行了对比，发现LAMP的灵敏度是PCR的10倍，并且简便易行，成本低廉，比其他基于PCR的方法更适合MS的检测。为了防止假阳性的出现，实验操作过程中将配置反应体系的区域、加样区域和结果观察区域进行严格分区。同时，使用Calcein+MnCl2替代SYBR GreenⅠ和Gene Finder，在配置反应液时就加入其中，避免了常规LAMP方法需要在反应后加入染料显色容易造成污染的问题。

4 不足之处

LAMP方法建立时间还不长，不可避免地存在着一些缺点和不足，例如：检测结果只有阳性与阴性两种，只能定性不能定量，一旦产生非特异性扩增，不易鉴别。靶序列长度只能控制在300 bp以内，不适合长片段的扩增。采用了多条引物，而且是在恒温条件下进行扩增，引物之间可能形成互补而扩增出非特异性的条带，造成假阳性[18]。

5 前景展望

LAMP检测方法在动物病原检测上具有广阔的应用前景，有常规PCR方法无可比拟的优势：LAMP的整个扩增过程均在恒温条件下进行，规避了常规PCR对于温度升降的步骤，不仅不要使用昂贵的仪器设备，同时也大大缩短了反应时间，更加符合基层兽医站和临床一线对快速诊断的需要。反应副产物——焦磷酸镁形成的浑浊度使得反应结

果更加容易观察和判定。由于该方法的简便易行，该技术有望在基层检测中大面积推广。

[1] 陈锴，姚华伟，王长江，等. 荧光定量PCR作为猪瘟兔化弱毒疫苗效价检验替代方法的研究与应用[J]. 中国农业科学，2013（1）：162-169.

[2] 曲光刚，杨慧，唐娜，等. 猪瘟病毒RT-LAMP快速检测方法的建立和应用[J]. 黑龙江畜牧兽医，2010（15）：121-123.

[3] Notomi T， Okayama H， Masubuchi H， et al . Loopmediated isothermal amplification of DNA [J] Nucleic Acids Research，2000，28 （12）：E63.

[4] Soliman H， Saleh M， El-Matbouli M.Detection of Fish Pathogens by Loop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP） Technique [J]. Methods Mol Biol.2015，1247：163-173.

[5] 李启明，马学军，周蕊，等.环介导逆转录等温扩增技术（RT-LAMP）在丙型肝炎病毒基因检测中的应用[J]. 病毒学报，2006（5）：334-338.

[6] 匡燕云，李思光，罗玉萍. 环介导等温扩增核酸技术及其应用[J].微生物学通报，2007（3）：557-560.

[7] Liu J， Nian Q G， Li J，et al. Development of reversetranscription loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of novel avian influenza A （H7N9） virus [J]. BMC Microbiology. 2014，14（1）：271.

[8] 秦智锋，曾少灵，阮周曦，等.口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2008（5）：375-378.

[9] 冯瑜菲，朱颖，刘文鑫，等.产志贺毒素Ⅱ型变异体大肠杆菌LAMP检测方法的建立[J].中国兽医科学，2011（3）：287-291.

[10] 许邹亮，南文龙，周洁，等.布鲁氏菌环介导等温扩增（LAMP）可视化检测方法的建立[J].中国动物检疫，2011，28（8）：37-40.

[11] 刘业兵，张磊，宁宜宝，等. 猪细小病毒LAMP检测方法的建立[J].中国农业科学，2010，14：3012-3018.

[12] 张坤，刁有祥，鞠小军.鸭瘟病毒环介导等温扩增（LAMP）快速检测方法的建立与应用[J].中国兽医学报，2013（4）：520-525.

[13] 张改平，何文博，王德国，等.猪瘟强毒株与兔化弱毒疫苗株的LAMP鉴别检测[J].郑州大学学报（理学版），2014（3）：85-90.

[14] 陈兵，胡运发，孙洁，等.新城疫病毒实时荧光RT-LAMP检测方法的建立[J]. 动物医学进展，2014（7）：11-14.

[15] 李鹏，马艳娇，于剑，等.猪肺炎支原体环介导等温扩增检测方法的建立[J].中国生物制品学杂志，2011（4）：480-483.

[16] 邓显文，谢芝勋，谢志勤，等.鸡滑液支原体LAMP快速可视化检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2014（1）：46-49.

[17] 陈伯祥，杨明，常亮，等.环介导等温扩增技术在动物传染病诊断中的应用进展[J].动物医学进展，2012（4）：90-96.

Loop-mediated Isothermal Amplif cation and Its Application in Animal Disease Diagnosis

Hu Cheng1，Cheng Darong1，Yu Shupei1，Zhao Fang1，Su Lingling1，Cai Shudong1，Gu Lingling1，WangYongjuan2
（1. College of Veterinary Medicine，Yangzhou University Yangzhou，225009，China；2. Jiangsu Animal Husbandry and Veterinary college，Taizhou，225300，China）

The loop-mediated isothermal amplification（LAMP）is a new nucleic acid amplification method. Due to its high specificity，efficiency，simplicity，rapidity and cheapness，more and more veterinarians focus on the method. At present，LAMP has been widely used in detecting various pathogens. In this review，the principle，process and application of LAMP were introduced，its short-comings were pointed out and the future development in animal disease diagnosis was prospected in order to provide theoretical basis for clinical application.

loop-mediated isothermal amplification；animal disease diagnosis；application

S854.4

A

1005-944X（2015）04-0046-05

江苏省博士后科研资助计划项目（1401077B）；国家自然科学基金项目（31302096）；江苏农牧科技职业学院2014年度重点支持项目（NSFZD1405）；扬州朝天歌农牧科技有限公司横向合作项目（00010114012）。

成大荣