PCR假阳性的原因分析及控制措施

南文龙，张悦勇，陈义平

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

PCR假阳性的原因分析及控制措施

南文龙，张悦勇，陈义平

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

近二十年来，PCR作为一种重要的分子生物学技术，广泛应用于动物疫病的病原学、诊断方法、基因工程疫苗研究、检验检疫、疫病诊断、疫情监测及流行病学调查等动物疫病防控实际工作。如何控制好PCR检测的质量，减少假阳性，一直是研究者普遍关注的问题。本文分析了PCR假阳性形成的原因，提出预防及控制措施，为促进实验室PCR实践工作提供参考。

PCR；假阳性；原因分析；控制措施

PCR是一种快速、敏感的分子检测方法，通过使用特定的引物，将微量的模板DNA在DNA聚合酶作用下进行指数扩增，再对扩增放大后的“信号”进行识别，大大提升了对病原微生物的检测能力。各省、市级动物疫病防控机构及规模化养殖企业普遍配置PCR仪，PCR技术已广泛应用于检验检疫、疫病诊断、疫情监测及流行病学调查等动物疫病防控工作。

假阳性是指检测阴性样品时，得出阳性结果。PCR技术具有较高的敏感性，这是其突出的优势，但也容易出现假阳性，被检样品即使污染了微量的模板核酸，也会被检测为阳性。1988年，Lo等[1]首次报道了PCR假阳性，在检测HBV过程中，由于PCR引物污染了含有HBV全长基因的质粒，导致检测时出现假阳性。在PCR检测中，如何有效避免假阳性、控制并去除潜在的风险，一直是研究者普遍关注的问题。本文拟分析讨论PCR假阳性形成的原因，提出预防及控制措施，为促进实验室PCR实践工作提供参考。

1 假阳性形成的原因

一般来说，假阳性多数是由污染造成的。

1.1 “一般性污染”造成的假阳性

“一般性污染”指模板核酸污染于试剂、耗材、设备或环境。若这种情况发生，通常每个检测样品都会受到污染，而污染后的样品检测均为阳性，这也是导致PCR检测假阳性发生的主要原因之一[2]。这种类型的污染大致可分为两类，第一类是“工厂源性的污染”，指试剂、耗材在出厂时已经发生污染，原因可能是其制备过程中或在工厂环境里受到污染。很多试剂和酶的制备过程涉及使用酵母、真菌（如溶细胞酶），而在DNA提取时如使用受污染的试剂处理检测样品，就会导致假阳性的发生。Rimek等[3]发现，来源于2个不同厂家的不同批次的溶细胞酶，都含有真菌DNA，采用真菌通用引物经PCR鉴定，发现其序列与多种酵母（酿酒酵母、巴氏酵母、奇异酵母等）基因序列100%同

源。此外，还有10× PCR buffer污染顶孢霉属真菌、Taq DNA聚合酶污染细菌DNA、核酸提取柱污染军团杆菌等报道。

第二类是“实验室源性的污染”，指污染发生在实验室内，主要污染物包括PCR产物、质粒、微生物等。具体如下：第一，实验室环境本身存在多种微生物（如曲霉等），如DNA提取时发生真菌孢子污染，可导致假阳性发生。第二，在同一实验室、或相邻实验室（甚至是楼上、楼下）开展与PCR检测相关的微生物培养、核酸样品制备、质粒提取、PCR产物分析等工作造成污染。污染物通过空气流动或人员活动，污染实验室环境、设施设备、耗材等，最终污染到检测样品。第三，在检测操作过程中发生污染，如用手直接接触试剂、耗材、设备设施，或未配戴口罩交谈说话，都有可能发生人源DNA成分的污染。

1.2 “样品性污染”造成的假阳性

“样品性污染”指模板核酸以“样品—样品”的方式污染到其他样品中，这种类型的污染一般影响较为局限，仅影响部分检测样品或单次检测结果[2]。包括：样品使用前不离心，使用时使劲打开离心管盖，形成液体飞溅或气溶胶，造成局部环境污染；试验流程不合理，先处理阳性对照或是高浓度核酸样品，造成低浓度核酸样品的污染；移液器操作不当，样品液体倒吸入移液器中，再污染到其他样品；没有正确、及时处理试验后的废弃物，敞开袋口，导致局部环境的污染；琼脂糖凝胶加样时，阳性PCR产物泄漏到邻近的加样孔等。

1.3 其他原因造成的假阳性

这种类型的假阳性并不需要存在模板核酸的污染，而是由于PCR反应条件优化不佳而产生非特异性扩增，或是尽管反应条件都优化完善但方法本身的特异性达不到100%[2]。此外，实验人员的技术能力也是产生假阳性的重要因素，如荧光定量PCR结果判定时，阈值取舍不合适，会直接导致假阳性的发生。

2 防控假阳性的措施

在选择预防和控制假阳性的措施时，要根据假阳性产生的原因来具体对待，核心是防止污染。

2.1 实验室管控

建议将PCR检测实验室分隔为试剂储存和准备区、样品处理区、基因扩增区和产物分析区4个独立的工作区域[4]。有条件的实验室，各功能区可设置独立隔间，并加装压力系统，通过不同的压力流向和强度控制各分区的气流，以防止空气中核酸污染及扩散。每个分区设独立的移液器、吸头、离心管、一次性手套、工作服等，不要交叉使用。试验操作时，按照技术流程，沿相应的功能区单向流动。同时，应关注同实验室内、以及不同实验室间人员的频繁流动，以防止因人员活动而引起的污染。

2.2 试剂、耗材管控

选择质量可靠的试剂，了解试剂的性能及各项指标是否符合要求，每批购进的试剂做阴、阳性对照试验，质量合格方可使用，避免因性能问题而导致的非特异性扩增[5]。可将试剂进行小量分装，一方面避免试剂反复冻融造成性能下降，另一方面减少打开试剂反应管的次数，避免污染。可选用一些具有抗污染功能的试剂，如用dUTP替代dTTP，在PCR反应前加入尿嘧啶糖基酶（UNG酶）进行处理，可以有效防止环境中PCR产物气溶胶对检测体系的污染。PCR试剂、反应液应与样品及PCR产物分开保存，不能放于同一冰箱内[5]。

使用一次性耗材，如吸头、移液管、离心管等，降低污染的可能性。选用带有滤芯的吸头，可避免阳性样品DNA对移液器的污染。但应注意，一次性耗材并不意味着没有污染，Schmidt等[6]发现，不同厂家来源的一次性反应管的污染率在20%到80～90%，其最主要的污染物是人源DNA成分。如果不是使用一次性耗材，必须做好消毒及处理工作，但必须注意有些消毒方式（如高压消毒），并不能完全消除耗材表面的DNA成分。

2.3 检测操作管控

在选择检测方法时，优先选择以国际、区域、国家或行业标准发布的方法；当需要自行建立检测方法时，必须经过验证和确认后才能予以应用[5]；定期开展实验室间比对也是不可或缺的外部质量控制手段。通过上述措施保证所用检测方法的敏感、特异，减少假阳性的出现。此外，优先选择荧光定量PCR类方法，一方面是由于荧光方法通常比常规PCR特异性更好，另一方面由于其结果判定时

不需要打开管盖，大大降低了污染的可能；可选用自动化核酸提取设备，也能减少样品处理过程中污染概率[7]。

实验人员需经过必要的技术培训，检测操作时严格遵守规程，优化各项具体操作，遇到污染的情况能及时进行处理。具体包括：收集的样品送往实验室过程中，应当保存于合适的密闭系统中；用于PCR检测的样品应单独保存，并防止开盖另作它用；佩戴手套、口罩等，防止直接接触或飞沫污染；试剂、样品使用前要瞬时离心，小心打开离心管盖，保证浓度的准确且防止液体飞溅或形成气溶胶；操作时须仔细认真，防止试剂被污染、样品间的交叉污染 ；样品加样时，遵循从低浓度到高浓度的顺序，最后加阳性对照；在保证结果有效的情况下，尽量减少PCR的循环数；设计好实验对照，一旦出现假阳性结果便于排查原因；实验结束后，废弃物及时按医疗垃圾处理，防止污染。

2.4 污染清除

2.4.1 酶处理。许多酶都具有破坏PCR反应液中DNA的能力，如DNase I、核酸外切酶III及限制性酶等。通过添加酶，DNA可以被降解，而DNA聚合酶活性不受影响。采用这一方法时，需在上述酶灭活后，再加入模板核酸 ，但要注意再开盖的过程会增加污染的可能性[2]。

2.4.2 照射。紫外线照射可以用来清除耗材、实验区环境、设施设备表面的核酸污染。其原理是氧化作用诱导了DNA单、双链断裂，相邻的嘧啶碱基之间形成环丁烷-嘧啶二聚体，抑制DNA聚合酶介导的DNA链延伸。但紫外线去除核酸的效果取决于距离、强度、波长、曝光时间等因素。紫外线照射可作为一种预防措施，但不能替代良好的实验操作习惯[2]。

2.4.3 清洁剂。最常用的清洁剂是0.1%次氯酸钠，常用于实验区设施设备的清洁，其机制也是氧化作用。Prince等[8]研究表明，0.08%次氯酸钠作用5分钟，可以清除76 bp大小的核酸片段。但要取得良好的效果，需保证次氯酸钠是新鲜配制的。

2.5 PCR阳性结果解释和利用时需注意的问题

在控制好假阳性的同时，我们对真实的PCR阳性结果进行解释时，也应持审慎的态度。PCR扩增技术敏感性很高，将微量的信号放大，但有时并不具有临床意义，一方面微量微生物的感染并不会导致最终的临床发病，另一方面即使是死亡或降解的微生物都有可能产生PCR阳性的结果[2]。相关研究表明，按标准诊断方法获得的临床检测结果有时与PCR结果并不一致[9]。因此，对某种疾病诊断时，须参照相关标准或技术规范所规定的该病确诊条件来进行。

3 小结

PCR检测由于其快速、敏感的优势而得到广泛应用。做好PCR检测的质量控制，减少假阳性，需从人员、实验室、试剂、耗材、检测方法、检测过程等多个环节全面考虑，且“防重于治”。一旦出现因污染导致的假阳性，一方面排查原因较为困难，另一方面即使找到原因根除污染也很不易。在实际工作中，可以根据本文所述，综合运用多种防控措施以减少及消除假阳性，确保PCR检测结果的可靠。

[1] Lo YM，Mehal，WZ，Fleming KA. False-positive results and the polymerase chain reaction[J]. Lancet，1988，2（8612）：679.

[2] Borst A，Box AT，Fluit AC. False-positive results and contamination in nucleic acid amplifi cation assays：suggestions for a prevent and destroy strategy[J]. Eur J Clin Microbio Infect Dis，2004，23（4）：289-299.

[3] Rimek D，Garg AP，Haas WH，Kappe R. Identification of contaminating fungal DNA sequences in zymolyase[J]. J Clin Microbiol，1999，37（3）：830-831.

[4]毛源，王 晶，汪 钦．临床基因扩增实验室的质量控制[J]．检验医学与临床，2012，9（23）：125-126.

[5]刘贺. 兽医实验室RT-PCR的质量控制[J]. 动物医学进展，2013，34（10）：115-117.

[6] Schmidt T，Hummel S，Herrmann B. Evidence of contamination in PCR laboratory disposables[J]. Naturwissenschaften，1995，82（9）：423-431.

[7] Valentine-Thon E. Quality control in nucleic acid testing--where do we stand? [J]. J Clin Virol，2002，25（s3）：S13-21.

[8] Prince AM，Andrus L. PCR：how to kill unwanted DNA[J]. Biotechniques，1992，12（3）：358-360.

[9] Hoorfar J，Wolffs P，Rådström P. Diagnostic PCR：validation and sample preparation are two sides of the same coin[J]. APMIS，2004，112（11/12）：808-814.

（责任编辑：胡藕祥）

Cause Analysis and Control Measures for False-positive Reactions in PCR Assays

In the past two decades，as an important technology in molecular biology，PCR has been widely used in the research，prevention and control of animal diseases. How to control the quality of PCR assays and reduce the false-positive rate，are always the problems concerned by the researchers. To promote the laboratory PCR practice，the reasons for formation of PCR false-positive results，were analyzed in this paper and the prevention and elimination measures were recommended.

PCR；false-positive；cause analysis；control measures

Q7

A

1005-944X（2015）08-0056-03