牛细管冻精解冻后常温保存对受胎率的影响试验

张宝良，马玉婷，孔 伟，窦世玲，尹世东，黄万光

(甘肃省家畜繁育中心，733000)

牛细管冻精解冻后常温保存对受胎率的影响试验

张宝良，马玉婷，孔 伟，窦世玲，尹世东，黄万光

(甘肃省家畜繁育中心，733000)

[目的]为测试牛细管冷冻精液解冻后在常温水中的保存时间对精子活力的影响，为非定点配种寻求有效简便的冻精携带方法，观察精子在不同解冻温度下的存活时间及受胎率。[方法]选择5个解冻温区及不同时间解冻肉牛细管冻精，解冻后置于常温水(17～19℃)中保存，观测解冻温度和精子存活时间对受胎率的影响。[结果] 50℃、60℃、70℃、解冻后精子的保存时间差异不显著，保存至72h时精子活力均低于0.35；受胎率差异不显著；随保存时间延长，受胎率呈下降趋势，在48h以内情期受胎率和总受胎率分别维持在61.8%～67.1%和91.9～95.8。[结论]70℃各时间段解冻后保存效果最佳，60℃解冻组次之，二者在精子活力≥0.35时情期受胎率和总受胎率达到63.0%、92.5%，略高于当地黄牛两项受胎率的平均值61.1%、91.7%，解冻后细管精液置于常温水中携带到较远的区域输精对精子活力、母牛受胎率无影响。

细管冻精；解冻时间；解冻温度；精子活力；保存时间；受胎率

人工授精技术做为当今发展养牛业的重要技术措施，具有提高优秀种公牛的利用率，大幅度减少种公牛饲养量，节约饲料和管理费用，以及不受时间、地域和种公牛生命的限制等优越性，在牛繁殖改良中发挥着极其重要的作用。很多地区各种自然条件的限制不能使人工授精技术优势充分发挥；一是随着我国肉牛养殖业的转型和养殖结构的变化，拉牛上站配种时代已基本结束，送技术上门和主动服务成为市场主流，现场操作受诸多条件限制，缺乏必要的交通工具，下乡服务液氮容器的携带就很困难，再者成本也较高，对储存的其余冻精影响也很大。二是养殖场规模较大的场区，配种室距授配母牛距离较远，配种母牛较多，冻精解冻后没有好的便捷方法携带，外界温度不易控制，对精子活力和受胎率影响较大。对针对这些问题，本试验采用不同温度、不同解冻时间解冻牛细管冻精，通过常温水长时间保存，对比分析解冻后精子活力及生存时间，旨在寻找最佳解冻温度、解冻时间及常温水中保存时间，提高细管冻精解冻后活力和受胎率，解决以上问题。

1 材料与方法

1.1 试验动物及材料

1.1.1 动物来源 试验动物选自甘肃省家畜繁育中心繁育场和凉州区12个配种站点的201头膘情中上，发情正常，无生殖道疾病的适龄母牛。

1.1.2 试验器材 甘肃省家畜繁育中心种公牛站按GB4143-2008生产的0.25ml牛细管冷冻精液、数字解冻器、10L液氮罐、载玻片、盖玻片、光学显微镜、温度计、恒温板、镊子等。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 用数字精液解冻装置在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃五个温区解冻牛细管冻精，将不同温区最佳时间段解冻效果好的冻精置于常温水中保存，12 h前每隔4 h、12 h后间隔12h检测记录精子活力，在两个时间段检测出现活力低于0.35时，再逆时推检直至所有解冻细管冻精活力低于0.30，最终筛选出精子活力大于0.35的最长保存时间，再进行人工授精，测定保存后精子对的受胎率的影响。

1.2.2 解冻方法 在数字精液解冻器上设置好解冻温度，待达到所需温度时，用镊子从液氮罐中迅速抽取一支细管冻精，轻轻甩掉液氮，立即将其放入准备好的解冻器中并轻轻摇晃，达到设定时间后把细管取出，置于装满自来水500 mL小口瓶(受季节不同，水温有浮动，平均维持在14℃左右)中室内保存，解冻好试验所需数量细管冻精后，取三支细管冻精擦干，剪去两头封口端用取10ul精液于载玻片上加盖玻片后，在带有恒温板(恒温板温度设置38℃)的光学显微镜下观察精子活力，每个镜片观察3～5个以上视野，进行活力评判并记录。

1.2.3 配种方法 选择解冻后常温水中保存精子存活时间≥48 h、活力≥0.35的解冻温区解冻后的冻精，于2 h、12 h、24 h、48 h后给发情母牛适时输精，每次使用冻精1～2支。在21 d、45 d、60 d、90 d观察和直肠检查母牛受孕状态, 测定情期受胎率和总受胎率，将≥21 d未发情确定为情期受胎率，>90 d以上未发情，直肠检查已受孕按总受胎率计算。

1.2.4 数据统计分析 用Excel 和SPSS13.0统计分析试验数据，结果用平均值来表示。

2 试验结果

2.1 解冻温度和时间对精液活力的影响

镜检三个视野直线前进精子数达0.35以上为合格，不同解冻温度、时间下的精子活力见图1。由图1可知，不同解冻温度、时间下的精子活力各异。温度越高，所需解冻时间越短，但随解冻时间的延长，精子死亡也越快。同一解冻温度下解冻时间长短不同，精子活力也不相同，不同解冻温区都有一个最佳解冻时间段。90℃细管冻精的最佳解冻时间范围为3～4 s，解冻活力0.4～0.45；80℃最佳解冻时间为4～5 s，解冻活力0.45；70℃最佳解冻时间范围为4～6 s，解冻后活力0.41～0.45，显著高于其他时间段解冻后的活力；60℃最佳解冻时间范围为7～8 s，解冻后活力0.40，高于其他时间段解冻后的活力；50℃的最佳解冻时间范围为20～30 s，解冻后活力0.4～0.43；而80℃2 s、70℃2 s、60℃2 s和3 s、50℃2 s和3 s解冻后精子没能复苏；90℃5 s、807 s、70℃8 s、60℃12 s解冻后冻精精子全部死亡。

2.2 常温水中保存对精子活力的影响

不同温度、时间解冻细管冻精后的保存效果如表1所示。由表1可见：不同温度、时间解冻细管冻精后，随保存时间延长，精子活力均呈下降趋势。其中90℃和80℃解冻组精子活力下降幅度较快，保存时间较短。在0～4 h内精子活力差异不显著(\%P>0.05)；\%8 h以后活力下降明显，显著低于前几个小时(\%P\%<0.05)；保存至24h、36h时精子活力均低于0.35。70℃、60℃、50℃解冻组精子活力下降幅度缓慢，保存时间达72 h时，各组活力降至0.35以下，时间明显长于90℃和80℃两组；解冻后0～12 h内，70℃组的平均精子活力显著高于其他两组(\%P\%<0.05)，60℃解冻组次之，且70℃和60℃解冻组的精子活力维持在0.37～0.44之间；12～48 h时各组精子活力基本维持稳定，保持在0.35～0.36之间，各组差异不显著(\%P\%>0.05)。

2.3 解冻温度和保存时间对受胎率的影响

不同解冻温度和保存时间对受胎率的影响见表2，由表2可以看出在50℃、60℃、70℃三个温区解冻后的冻精对母牛受胎率影响差异不显著(\%P\%<0.05)；随冻精保存时间的延长，母牛情期受胎率和总受胎率均有所降低，在48小时以内，情期受胎率和总受胎率分别维持在61.8%～67.1%和91.9%～95.8%，平均情期受胎率和总受胎率达63.0%、92.5%，略高于当地黄牛两项受胎率的平均值61.1%、91.7%。

3 结论与讨论

3.1 解冻温度和时间对精子存活时间的影响

试验结果表明，在50～90℃5个温区范围内解冻牛细管冻精，每个温区都内都有一个解冻的最佳时间段，90℃解冻的最佳解冻时间是3 s～4 s，80℃是4～5 s，70℃是4～6 s，60℃是7～8 s，50℃是20 s～30 s。在这些温区解冻细管冻精后于常温水中保存的效果各有差异。其中以70℃保存效果最佳，解冻后精子活力最高，保存时间最长，60℃次之。90℃和80℃解冻后保存时间较短。说明冻精解冻后的保存效果与解冻温度有很大的关系，在解冻精液时如何快速越过精子的冰晶期这是一个重要环节[1]。精子在冰晶化、玻璃化及复苏时最容易发生死亡，也是解冻后精液活力快速下降的主要原因之一。高温快速解冻可以使精子冰晶化、玻璃化及复苏时间大大缩短，从而使精子细胞结构得到保护，使精子损伤降到最低，减少了精子不必要的死亡，提升了解冻后精子的活力；低温精子处于休眠状态，活动量降低，精子能量消耗少，精子死亡率小[1-2]，将高温解冻后的冻精放入常温水中保存，可以有效延长精子的保存时间，500 ml水在20～25℃自然条件下24h升温不到2℃，不会造成保存环境温度出现波动起伏，很好的保持了精子生命状态的稳定，延长了保存时间和维持受精的能量，用此方法运输保存解冻后的牛细管冻精，在牛改良上门服务、偏远地区及养殖场配种，携带解冻后冻精非常经济方便。

3.2 解冻温度和保存时间对受胎率的影响

母牛受胎率的高低，直接影响着品种改良速度和养殖者的经济效益，而受胎率的高低与冻精的解冻温度，输精时间、牛的膘情、发情时间等因素息息相关[3]。从试验结果也可以看出，随着冻精保存时间的延长，母牛情期受胎率和总受胎率均呈下降趋势，分析其原因主要是，随着冻精保存时间的延长，精子的能量耗损逐渐升高，代谢产物积聚，降低和抑制了精子活动能力，导致受胎率下降。在细管冻精解冻过后的24 h以内用于配种对受胎率影响不大，此法也可用于冻精解冻后，母牛处在不适宜配种阶段的精液短时间保存，有效延长解冻后精液携带保存时间，对交通不便、技术人员较少、路途遥远的散养户和场区较大、操作间距离配种点较远的饲养场，具有很大的优势。对加快黄牛改良步伐、适当减少配种点、降低黄牛改良的投入和成本、提高肉牛细管冻精受胎率意义重大。

[1] 张永春,张显华,刘东升,等.解冻温度和保存时间对牛细管冻精精子活率的影响[J].中国奶牛,2013.15:60-62.

[2] 郝爱玲,阿淑艳,李淑坤.不同温度解冻对冻后精子活力及生存时间的影响[J].中国奶牛业发展会,2006,2:683-684.

[3] 刘小明,李东.解冻精子存活时间对受胎率的影响[J].宁夏农林科技,2000.6:35-36.

Impact on conception rate of the thawed bovine straw semen preserved in water at room temperature

ZHANG Bao-Liang , MA Yu-ting , KONG Wei , DOU Shi-ling , YIN Shi-dong, HUANG Wan-guang

(LivestockbreedingcenterinGansuProvince, 733000 )

[Objective] To test the effect of storage time in water at room temperature of cattle straw frozen semen after thawing on sperm motility, seek effective and easy semen carrying method for non- sentinel mating , observe the survival time and conception rate of thawed sperm at different temperatures . [Method] At 5 thawing temperature zones and different time thawed beef thin tube semen, after thawing preserved in the water at room temperature (17 ～ 19 ℃), observed effect of thawing temperature and sperm survival time on conception rate . [Results]At 50 ℃, 60 ℃, 70 ℃ thawed, the saved time of sperm was no significant differences , when saved to 72h sperm motility were lower than 0.35 ; conception rate was not significant ; With prolonged storage time, the conception rate declined, within 48h estrus conception rate and overall conception rate remained at 61.8% ～ 67.1% and 91.9 ～ 95.8% . [Conclusion] Thawed each time of 70 ℃, preservation effect is the best , 60 ℃ followed, both in sperm motility ≥ 0.35 when estrus conception rate and overall conception rate reached 63.0% , 92.5% , slightly higher than the local cattle two of the average conception rate 61.1% 91.7% . Saved the straw semen in water at room temperature after thawing, carry to far regional inseminated, had no effect on sperm motility and pregnancy rate.

thin tube semen ; thawing time ; thawing temperature ; sperm motility ; retention time ; conception rate

2014-12-26 修改日期:2015-01-20

张宝良(1986-)，男，甘肃靖远县人，本科，助理畜牧师，主要从事牛冷冻精液生产技术工作。

S8-1

A

1001-9111(2015)02-0041-04