兔魏氏梭菌的分离鉴定及药敏试验

王友良（山东省临沂市兰山区义堂畜牧兽医站 276000）

兔魏氏梭菌的分离鉴定及药敏试验

王友良（山东省临沂市兰山区义堂畜牧兽医站 276000）

魏氏梭菌病本病又称产气荚膜杆菌病是由A型魏氏梭菌产生外毒素引起的肠毒血症，本病的发生无明显季节性，除哺乳仔兔外，各种年龄、品种、性别的兔子均有易感性。以发病突然、急性腹泻、排黑色水样或带血的胶冻样、腥臭粪便、盲肠浆膜出血斑和胃粘膜出血、溃疡为主要特征。发病率和死亡率均较高。

1 试验材料与仪器

1.1 试验材料

1.1.1 病料来源

临沂市兰山区义堂镇恒源养兔场发病死亡兔4只。

1.1.2 培养基及试剂

普通肉汤培养基（购自青岛高科园海博技术有限公司）、琼脂粉（购自天津市光复精细化工研究所）、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）（北京陆桥技术有限责任公司）、伊红美蓝琼脂（中国兽医药品监察所北京中海生物科技有限公司）、麦康凯琼脂（中国兽医药品监察所北京中海生物科技有限公司）。

1.1.3 药敏试验纸片

药敏试纸片（由临沂大学兽医预防医学实验室提供）。

1.1.4 试验动物

10日龄鸡胚6枚，2日龄雏鸡6只，19～23g小白鼠6只，均由临沂大学兽医预防医学实验室提供。

1.2 试验仪器

SW-WJ-LCU洁净工作台、酒精灯、接种环、镊子、培养皿、生化培养箱、试管、试管架、高压锅、显微镜、玻片、革兰氏染色液、药敏片、生化管、锥形瓶、玻璃棒、电热炉、手术剪、废物缸，1ml注射器、厌氧培养缸、烧杯、量筒、250ml锥形瓶、300ml锥形瓶等。

2 试验方法

2.1 临床诊断

急剧腹泻。患病兔最初的粪便变形、变软，很快转为带血的胶冻样、黑色或褐色稀粪，有恶臭腥味，肛门周围、后肢及尾部被稀粪污染；被毛粗乱，精神不振，拒食，脱水，无体温变化，最后消瘦死亡。剖开腹腔后有特异腥臭味，胃内充满饲料，胃底粘膜脱落，可见大小不等的溃疡。小肠充满气体，肠壁变薄，粘膜呈弥漫性出血。空肠和回肠内有大量的胶冻样液体和气体。盲肠和结肠内充满气体和黑绿色稀粪便，有腐败臭味。大肠内充满黑绿色稀粪，腥臭。肝脏稍肿、质地变脆，胆囊肿大、充满胆汁，脾呈深褐色，膀胱积有茶色尿液，肺充血、瘀血，心脏表面血管怒张，呈树枝状。

2.2 病原菌分离鉴定

2.2.1 各种培养基的制备

2.2.1.1 普通肉汤培养基制备

取一定比例的普通肉汤培养基加热溶于水中并不断搅拌至煮沸，煮沸1min后装于三角烧瓶，于高压锅灭菌后分装于试管中。

2.2.1.2 斜面培养基制备

取一定比例的胰蛋白胨大豆琼脂于水中加热煮沸至完全溶解，用高压锅灭菌后，分装于试管中，将试管斜放，凝固后制成斜面培养基。

2.2.1.3 普通琼脂培养基制备

取一定比例的胰蛋白胨大豆琼脂于水中加热煮沸至完全溶解，分装于平板中，用高压锅灭菌后，冷却待用。

2.2.1.4 伊红美蓝培养基制备

2.2.1.5 麦康凯培养基制备

取一定比例的麦康凯琼脂于水中加热煮沸至完全溶解，分装于平板中，用高压锅灭菌后，冷却待用。

2.2.1.6 血液琼脂培养基制备

取一定比例的胰蛋白胨大豆琼脂于水中加热煮沸至完全溶解，用高压锅灭菌后冷却至55℃左右，将适量兔血脱纤后加入其中混合均匀，分装于平板中，冷却待用。

2.2.1.7 半固体培养基制备

取适量琼脂粉加热溶于肉汤中至完全溶解，分装于试管中，用高压锅灭菌后，冷却待用。

2.2.2 涂片及染色

无菌操作用接种环在玻片上滴一滴生理盐水，然后用灭菌接种环取病死兔的肝脏、肠粘膜或肠内容物与生理盐水混合进行涂片，干燥、固定后进行革兰氏染色，然后用油镜进行观察细菌形态及特点。然后将细菌接种于斜面培养基上，37℃培养24h后，无菌操作取培养的菌落进行涂片，干燥、固定后进行革兰氏染色，用油镜进行检查。

但在后工业化时代里，“真实”“记忆”逐渐变成了沉重的话题。伯格继续写道，到20世纪后半叶，历史的审判已被所有人遗忘，后期资本主义国家由于对过去的恐惧和对未来的盲目，丧失了可信仰的正义和真实原则转而成为投机主义者。这种投机的心态使得所有的事物都蔚为奇观，就像电影里的场面。相机变成一种工具，表演的场面造就出一种我们所期望的“永恒现在式”。换句话说，记忆和真实不再是不可或缺和让人期待的。摄影为我们卸下了记忆和真实的负担，它像上帝一样监督着我们，同时也被我们所监督。[8]57

2.2.3 分离培养与观察

无菌操作用接种环挑取斜面培养基上的菌落，分别在普通琼脂培养基、伊红美蓝培养基、麦康凯培养基、血液琼脂培养基上进行分区划线。在生化培养箱中37℃恒温24h后，观察单个典型菌落的形态特点。

2.2.4 运动性观察

用灭菌的接种针取培养的纯菌，在无菌环境下将接种针垂直刺入半固体培养基中，在生化培养箱中培养24h后观察细菌运动情况。

2.2.5 生化试验

用灭菌的接种针取培养的纯菌，接种在生化管内，在生化培养箱中37℃恒温培养24h后，观察结果。

2.3 动物致病性试验

2.3.1 鸡胚接种

照蛋后画出气室及大血管的位置，酒精消毒后用大针在记号处钻一小孔待用。用注射取24h肉汤培养的菌液0.3ml从小孔处注入鸡胚尿囊腔中，用石蜡封孔后，将鸡胚放入生化培养箱中继续孵化，3d后观察结果。

2.3.2 雏鸡接种

将雏鸡分为试验组和对照组，每组3只。用注射器吸取24h肉汤培养的菌液0.5ml垂直注入试验组雏鸡腹腔，对照组雏鸡腹腔注射0.5ml灭菌的生理盐水，将雏鸡继续饲养观察。

2.3.3 小白鼠接种

将小白鼠分为试验组和对照组，每组3只。用注射器吸取24h肉汤培养的菌液0.5ml垂直注入试验组雏鸡腹腔，对照组雏鸡腹腔注射0.5ml灭菌的生理盐水，将雏鸡继续饲养观察。

2.4 药敏试验

无菌操作用灭菌接种环取纯培养物在盛有灭菌生理盐水的试管中混匀，将菌液倒入普通琼脂培养基中，晃匀后将菌液倒出。然后用灭菌的镊子分别夹取不同的药敏片放在培养基上（注意药敏片之间距离相等并保持一定的距离），然后将培养基放在生化培养箱中37℃恒温培养24h后，观察结果。

3 试验结果及分析

3.1 临床诊断结果

根据临床症状和病理剖检变可初步确诊该兔病由魏氏梭菌感染引起。

3.2 涂片染色结果

革兰氏染色后，油镜观察为革兰氏阳性的梭状杆菌，菌体较大，单个存在或多个成簇存在，有的形成圆形或椭圆形的芽孢，位于中央或近端，呈梭状，符合魏氏梭菌的形态特征。

3.3 分离培养结果

培养菌在肉汤中形成明显浑浊，试管底部有云雾状浑浊；在普通营养琼脂培养基上生长良好，形成乳白色光滑圆形菌落；在伊红美兰琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基不生长；在血液琼脂平板上有灰白色、边缘不整似锯齿样、表面光滑隆起、直径约2～4mm的菌落，周围有明显的溶血环。符合魏氏梭菌的生长特性。

3.4 运动性观察结果

该菌在生化培养箱中培养24h后观察细菌沿穿刺线生长，说明该菌无鞭毛生长，符合魏氏梭菌的生长特征。

3.5 生化试验结果

本菌在厌氧条件下能分解乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖，产酸产气，不能发酵甘露醇。符合魏氏梭菌的生化试验特性。

3.6 鸡胚接种结果

经尿囊腔接种鸡胚死亡，剖检鸡胚肠道有出血变化。无菌操作用接种环在鸡胚的肠粘膜取病料，革兰氏染色后，在油镜下观察为魏氏梭菌。

3.7 雏鸡接种结果

试验组雏鸡腹腔接种12～24h死亡。死雏出现了急剧下痢，并混有血液，剖检主要病理变化与自然感染的病例相似，肠道出血且肝脏肿大土黄色。无菌操作用接种环在死雏的肠粘膜取病料，革兰氏染色后，在油镜下观察为魏氏梭菌。对照组雏鸡正常。

3.8 小白鼠接种结果

试验组小白鼠腹腔接种12～24h死亡。死亡小白鼠出现了出血性下痢，剖检主要病理变化为肠道充满气体高度肿胀。无菌操作用接种环在死亡小白鼠的肠粘膜取病料，革兰氏染色后，在油镜下观察为魏氏梭菌。对照组小白鼠正常。

3.9 药敏试验结果

分离菌株对氟苯尼考、头孢菌素、庆大霉素等高度敏感，对红霉素、新霉素、阿莫西林中度敏感，对青霉素、卡那霉素、土霉素、四环素、复方新诺明产生了耐药。

4 讨论

（1）通过临床诊断、病理剖检及实验室诊断确定该分离菌株为魏氏梭菌，并进行了药敏试验，找出了对本菌的有效药物，能够及时防治疾病。

（2）通过对小白鼠、鸡胚和雏鸡的接种，可以判断该分离菌株为致病菌。

（3）通过对细菌来源及生活环境的调查，得出该菌存在广泛，对兔的感染主要是通过腐败的食物而传染，以及脏乱等含菌较多的环境，因此在日常养殖中，要做到饲喂安全营养的饲料并保持好环境卫生，防止细菌的传染传播。

（4）正确的饲养可减少本病的发生；采用较低能量、较高纤维素的日粮可明显减少腹泻死亡率。一旦发现病兔或疑似病兔，应立即隔离或淘汰。预防方法可用魏氏梭菌氢氧化铝灭活菌苗，每只兔皮下注射2ml，7d后开始产生免疫力，免疫期4～6个月。

（5）本病常规治疗，可内服土霉素、四环素，均有一定的疗效。但本次药物敏感性试验该分离菌对氟苯尼考、头孢菌素、庆大霉素高度敏感，兔在应用氟苯尼考、头孢菌素治疗时应严格掌握剂量，否则极易引起中毒，应慎用。另外可用高免血清治疗本病效果也较好。其方法是发现患病兔泻痢后，视病兔大小，每只皮下注射高免血清5～10ml，每天1次，连用2～3d即可康复。