猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定与药敏试验

谭素媚 聂立欣 付强

（1，广东省肇庆市农业学校 526070；2，佛山科学技术学院生命科学学院 528231）

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定与药敏试验

谭素媚1聂立欣1付强2*

（1，广东省肇庆市农业学校 526070；2，佛山科学技术学院生命科学学院 528231）

猪传染性胸膜肺炎是一种高度传染性呼吸道疾病，影响全球养猪业的发展。本研究采用多种培养基进行接种培养，从具有猪传染性胸膜肺炎临床症状病死猪的肺脏和胸腔渗出液分离到革兰氏阴性杆菌，通过细菌分离、涂片染色镜检、卫星现象试验、V因子依赖性试验诊断，最终确定所分离的细菌为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。通过药敏实验发现该分离菌对氟苯尼考、强力霉素和先锋Ⅵ等药物高度敏感，研究结果为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌病的诊断及治疗提供指导意义，同时也为进一步研究猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的致病机理奠定基础。

猪；传染性胸膜肺炎放线杆菌；病原分离鉴定；药敏试验

猪传染性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌引起的猪的一种高度传染性呼吸道疾病。该病主要表现为急性出血性纤维素性肺炎、慢性纤维素性坏死性胸膜肺炎，急性发病死亡率高，是当今危害养猪业的一种重要细菌性疾病[1]，严重危害着我国养猪业的发展。

在规模化养猪场中，猪传染性胸膜肺炎容易引起群发性死亡，造成较大损失[2]。2014年10月，广东省肇庆某猪场3月龄的猪发病并出现大量死亡。临床主要表现为被毛松乱、体温升高，耳、鼻及四肢皮肤呈蓝紫色，咳嗽、呼吸极度困难，有的呈犬坐姿势，临死前口鼻孔流出血色或白色的泡沫。剖检见胸腔含有粉红色液体，心包积液，纤维素性心包炎，纤维素性腹膜炎、肺炎，胸壁和肺粘连很严重。为更好的控制该病，本实验通过病原分离鉴定确定细菌，并以此为依据做药物敏感性试验，提出合理的防治方案。

1 材料和方法

1.1 试剂和培养基

生化微量鉴定管、培养基、药敏纸片等均购于广州瑞舒生物科技公司；金黄色葡萄球菌及V因子（NAD，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）为佛山科学技术学院预防兽医实验室保存。

1.2 V因子需要试验

分离菌株分别接种于含有终浓度为0.01%V因子和无V因子的普通营养肉汤中，在37℃需氧和厌氧条件下培养24～48h后，观察和记录试验结果。

1.3 卫星现象试验

将鲜血琼脂培养基划线接种金黄色葡萄球菌并垂直划线分离的细菌，37℃培养24～48h。

1.4 生化鉴定

用分离菌纯培养物进行下列试验：硝酸盐还原、尿素酶、靛基质、MR、VP试验、葡萄糖、乳糖、硫化氢、接触酶、水杨苷、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、果糖、木糖、柠檬酸盐、山梨醇等糖发酵试验[3]。接种前在发酵管中加入2μL的1%的NAD。

1.5 药敏实验

蘸取分离菌的肉汤培养物，接种于血琼脂平板，将各种药敏纸片分别平贴于培养基表面，37℃培养24h，测定抑菌环。

2 结果

2.1 镜检结果

病料接种于巧克力培养基，37℃培养发现菌落为露珠状、约2～3mm大小，闪光不透明。经革兰氏染色，可见革兰氏阴性球杆菌，菌体细小，也可见杆状、丝状散在菌体（见图1）。

2.2 细菌分离培养特征

在普通平板、麦康凯培养基上不生长；在巧克力培养基上长成针尖大、灰白色、圆形隆起、闪光不透明的菌落；在鲜血琼脂培养基上长成更细小的透明菌落，密集时可看到形成一片β溶血区；挑取菌落染色镜检，符合猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的形态和染色特征。对比两种营养肉汤的浑浊度发现，添加了V因子的肉汤比不添加V因子的肉汤浑浊（见图2），生长更旺盛，表明该分离菌生长依赖V因子。

图1 分离细菌的显微形态（10×100，革兰氏染色）

卫星现象：普通琼脂平板上金黄色葡萄球菌线两侧有针尖大小、圆形、边缘整齐的菌落生长，离金黄色葡萄球菌越近菌落越大，越远菌落越小，远离葡萄球菌的地方甚至不生长，呈现出明显的 “卫星现象”。在分离菌和金黄色葡萄球菌的分界线处出现明显的溶血现象，表明分离菌与金黄色葡萄球菌具有协同溶血的作用。

图2 分离菌在营养肉汤培养基的生长情况

2.3 生化试验结果

由表1可知，分离菌能发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖和麦芽糖等；脲酶试验阳性，接触酶阳性，硝酸盐还原试验阳性。

表1 分离菌的生化实验结果

2.4 药物敏感试验结果

试验结果表明，该菌对氟苯尼考、强力霉素、头孢唑啉、环丙沙星、壮观霉素、阿米卡星、链霉素、先锋Ⅵ、哌拉西林、诺氟沙星、头孢拉定高度敏感；对红霉素、四环素中度敏感；对卡那霉素苄青霉素、庆大霉素为低度敏感，对氨苄西林、青霉素为耐药（见表2）。

表2 分离菌的药敏试验结果

3 讨论

本研究从肇庆市某猪场采集病料，发现分离菌为需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性短杆菌、球杆菌，偶尔有长丝状的多种形态细菌；营养需求较高，生长依赖V因子，在巧克力琼脂培养基上为透明的粘液型菌落等培养特性与大多APP报道的特性一致[4，5]。生化试验发现尿素酶、V因子依赖性、溶血性和木糖为阳性与标准菌株的指标一致。分离菌株大多数生化特性符合前人研究胸膜肺炎放线杆菌的结果，仅有几项指标与前期资料所介绍的不一致，可能由于APP营养要求较高而常规的生化发酵管营养成分不足或较低导致发酵迟缓，甚至出现假阴性。结合发病猪群的流行病学特征、临床症状、病死仔猪的组织病理变化和实验室检验结果，推测此分离菌为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。此类胸膜肺炎放线杆菌属于生物Ⅰ型，即依赖V因子（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD辅酶）生长的原胸膜肺炎嗜血杆菌。进一步对分离菌株进行血清型鉴定和致病力研究，将有助于阐明猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的致病机制。

分离菌对氟苯尼考、强力霉素和先锋Ⅵ高度敏感（这三种抗菌素被推荐为临床用药），对四环素、链霉素等药物敏感低，青霉素等不敏感，表明大多数药物对胸膜放线杆菌敏感性不高，也有可能是与这些药物在猪场的使用频率高有关。由于本病的蔓延流行和抗菌药物的长期应用，出现较多的耐药菌株，因此采用药物治疗时最好进行药敏试验，根据药敏试验结果，选择有效敏感药物进行治疗，才可获得较好的效果。防治本病除了使用较敏感的抗生素外，还应进行定期的免疫接种，加强饲养管理，应避免猪群拥挤，加强通风。这次在肇庆猪场发生这种疾病，可能就是由于气候条件的改变所引起，是否与血清型有关需要进一步的研究。

[1]厚华艳,梁武,吕茂杰,杨保收,等.猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗研究进展[J].动物医学进展,2015,36（2）:84-88.

[2]Frey J,Beck M,Nicolet J,Toxin typing of action-bacillus pleurpneumoniae by PCR[J].Veterinary Bulletin,1996,66（8）:5109.

[3]姚火春.兽医微生物学实验指导（第2版）[M].北京:中国农业出版社,2002.

[4]刘春花,张彦明,等.胸膜肺炎放线杆菌研究进展[J].中国兽医学报,2003,23（2）:206-208.

[5]张彦明,刘春花,等.胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及免疫预防[J].中国兽医科技,2002,32（5）:21-22.

广东省自然科学基金项目（2014A030310020）和广东高校优秀青年创新人才培养计划项目（2014KQNCX179）资助。

付强（1983-），男，博士，研究方向为临床兽医学。