牛副结核病的流行病学特征与实验室诊断技术研究进展

孙 雨，马世春，时建忠，魏 巍，董 浩，徐 一，苏增华，池丽娟，马继红，王晓英

（中国动物疫病预防控制中心，北京 102600）

专论与综述

牛副结核病的流行病学特征与实验室诊断技术研究进展

孙 雨，马世春，时建忠，魏 巍，董 浩，徐 一，苏增华，池丽娟，马继红，王晓英

（中国动物疫病预防控制中心，北京 102600）

牛副结核病（bovine paratuberculosis）是由副结核分支杆菌引起的以牛慢性增生性、顽固性肠炎和进行性消瘦为特征的人畜共患传染病。其临床症状与病理变化是顽固性腹泻、渐进性消瘦、慢性肉芽肿回肠炎，肠粘膜增厚并形成皱褶。除常规的临床诊断外，牛副结核病的确诊依赖于实验室诊断方法，主要有病原学诊断、血清学诊断和分子生物学诊断等方法。牛副结核病给畜牧业造成很大的损失。由于本病潜伏期长，传播快，加之人工培养副结核分枝杆菌难度又高，因此加强对该病的病原学、流行病学特征的认识，加快实验室诊断方法的研究对其综合防控工作具有十分重要的意义。作者主要介绍了目前国内外牛副结核病流行病学特征和诊断方法的研究进展，并比较了各种方法的优点和缺点，为牛副结核病的临床快速诊断和深入研究提供科学依据。

牛副结核病；流行病学；实验室诊断

牛副结核病（bovine paratuberculosis）是由副结核分支杆菌引起的以牛慢性增生性、顽固性肠炎和进行性消瘦为特征的人畜共患传染病［1］。牛副结核病又称副结核性肠炎或Johne病，主要临床症状和病理变化是顽固性腹泻、渐进性消瘦、慢性肉芽肿回肠炎，肠粘膜增厚并形成皱褶。人类的副结核病又称为克罗恩病（Crohn’s disease），是由食用被该菌污染的牛奶或奶制品而造成的人过敏性肠道症状、溃疡性肠炎［2］。克罗恩病是人慢性炎症性肠道疾病，其特征为肠道组织发生广泛性炎症反应与肉芽肿。由于本病潜伏期长，特征性症状不明显，人工培养分离难度较大，一旦发病在整个牛群传播速度较快、危害较大，动物发病后会给地方畜牧业带来较大的经济损失［3］。副结核病严重危害了人民群众的身体健康和生命安全，影响社会与经济的发展。因此，加强对该病的病原学、流行病学特征的认识，加快实验室诊断方法的研究对其综合防控工作具有十分重要的意义。

1　病原特征

1.1病原分类

副结核分枝杆菌（mycobacterium paratuberculosis，MP）在分类上属于分枝杆菌属。近年来的研究结果表明，该菌与禽分支杆菌有较多的相似性，变态反应也与禽分支杆菌有明显的交叉性［4］。

1.2病原的基本特征

副结核分枝杆菌为短杆菌，是一种细长杆菌，有的呈短棒状，有的呈球杆状，常呈纵排列，无鞭毛，无运动力，不形成荚膜和芽孢，革兰氏染色为阳性，抗酸染色为阳性。本菌为需氧菌，最适生长温度为37.5℃，最适pH值为6.8～7.2。该菌生长缓慢、原代分离极为困难，需在培养基中添加草分支杆菌素抽提物，一般需要6～8周才能发现小菌落［5］。

2　流行病学特征

2.1传染来源

病畜和带菌畜是主要传染源，反刍动物对副结核分枝杆菌易感，其中奶牛最易感。牛奶或奶制品是人类副结核病的主要感染源，其次是被副结核分枝杆菌污染的环境、水源等［6］。人与人的直接接触传播尚未见报道。

2.2传播途径

主要传播途径是动物采食污染的饲料和饮水，消化道是最常见的感染途径，也可通过精液和胎盘传播。最易感时期是出生后3个月的哺乳期，犊牛因摄取成年牛粪便污染的奶或饮水而感染。一般感染后3～6年不发病，而成为隐性感染［7］。

2.3易感动物

该病的自然宿主为反刍动物，如牛、绵羊、山羊、鹿及骆驼对本菌易感，且多见于母牛，尤其是在妊娠以及泌乳期的母牛最易感［8］。马、水牛、猪等也有自然感染的报道；实验动物，如家兔、豚鼠、大鼠、小鼠、鸡等小型实验动物都可以用来进行副结核感染研究。但鼠类实验动物最为易感，特别是BALB/c、C57/B6、SCID系鼠类［9］。

2.4流行特征

本病无明显的季节性，但常发生于春秋两季。潜伏期长，可达6～12个月或更长，主要呈散发，有时呈地方流行性。在青黄不接、草料供应不上、羊只体质不良时发病率上升。转入青草期，病羊症状减轻，病情见好转［10］。副结核病广泛流行于世界各国。养牛业较为发达的国家，例如美国、英国、德国、加拿大、澳大利亚、意大利、丹麦等国受害严重。我国辽宁、黑龙江、内蒙古、贵州、陕西、河北等地区也有发生过本病的报道，几乎遍及了东北、西北、华北大部分地区。近年来由于奶牛和肉牛养殖业发展非常迅速，生产规模越来越大，集约化程度越来越高，牛流动范围也越来越广，副结核发病也呈上升趋势［11］。

2.5对牛的致病性

幼龄期牛易感染副结核，尤其在1月龄内最易感染。动物发病缓慢，有反复加重和缓解的过程，腹痛轻重不一。发病时临床表现为渐进性消瘦，周期性、顽固性下痢，下痢呈喷射状、恶臭、粪便中常混有脱落的肠粘膜和血液。牛在发病后期极度消瘦，有时可见到下颌和腹下水肿，最后衰竭而死［12］。

3　实验室诊断技术

3.1细菌学检测

该法为活体定性方法，并且为目前世界上认可推荐使用的方法。其具体操作步骤：取病牛直肠病变部位组织的刮取物或粪便放入蒸馏水中混匀，离心后取沉淀物用萋-尼氏抗酸染色显微镜下观察。如果是阳性病料，显微镜下可见红色球杆状成团的细菌。该方法的缺点是由于粪便或者直肠刮取物中含有其他抗酸菌，所以容易干扰副结核分枝杆菌的检测［13］。

3.2皮内变态反应诊断（PPD试验）

副结核的皮内变态反应诊断主要使用提纯的副结核菌素对动物进行皮内注射，一般使用剂量为0.1 mL，作用72 h后仔细观察局部有无热痛、肿胀等炎性反应，并以卡尺测量皮皱厚度，作好详细记录。对疑似反应牛应立即在另一侧以同一批PPD同一剂量进行第二次皮内注射，再经72 h观察反应结果。对阳性牛和疑似反应牛，于注射后96 h和120 h再分别观察一次，以防个别牛出现较晚的迟发型变态反应。一般的判定标准：阳性反应局部有明显的炎性反应，皮厚差大于或等于4.0 mm；疑似反应的判定为局部炎性反应不明显，皮厚差大于或等于2.0 mm、小于4.0 mm；阴性反应的判定为无炎性反应，皮厚差在2.0 mm以下。本方法能检测出副结核感染前期的大部分发病动物，对于感染中后期以及处于耐受期的动物敏感性不强或者不出现反应状态。另外其他一些分枝杆菌，如禽型结核分枝杆菌、鸟胞内分枝杆菌可以干扰副结核分枝杆菌的检测［14］。

3.3补体结合试验（CFT）

补体结合试验方法为检测本病最早的方法，并且是国际上常用的一种经典检测方法，它的优点与PPD检测方法一样可用于动物感染前期的抗体检测。缺点是容易出现假阳性反应，并存在一些非特异性的反应，操作程序复杂，不适用于血清样品的大规模检测［15］。

3.4γ-干扰素ELISA检测方法

动物感染副结核分枝杆菌后的前期并不产生抗体，只有在临床症状阶段才产生抗体，所以使用血清学方法不能准确地鉴定动物是否患有副结核病。γ-干扰素ELISA检测方法则可以用于检测副结核病的亚临床感染状态。γ-干扰素ELISA检测方法的原理是动物感染病原后，循环淋巴细胞对病原致敏，致敏后的淋巴细胞遇到副结核分枝杆菌或结核分枝杆菌抗原后会在体外模拟迟发型变态反应。发生迟发型变态反应后，致敏的淋巴细胞会释放出γ-干扰素［16］。γ-干扰素是可以用于ELISA方法进行检测的，并且检测的含量与副结核分枝杆菌的含量呈正相关性。该方法的优点是特异性强、敏感性好，可用于检测动物的亚临床感染状态；缺点是采集的动物血清必须经过前期刺激抗原的致敏处理，操作过程较为繁琐［17］。

3.5酶联免疫吸附实验方法（ELISA）

酶联免疫吸附实验方法是近几年研究学者们比较关注的一个方法，并有可能取代PPD试验与CFT试验，用于样品的大规模初筛检测［18］。目前使用的ELISA方法大多为直接ELISA方法，其优点是快速、简便、可用于大规模定性检测。但由于其敏感性较差，所以一般定量检测还需要CFT试验与γ-干扰素检测方法辅助进行［19-21］。

3.6胶体金检测技术

该方法是胶体金标记羊抗兔IgG抗体，检测动物副结核病IgG1抗体的银加强胶体金技术。用本法检测动物血清中抗副结核分枝杆菌IgG1抗体的可信度高，并且具有敏感、特异、简易、经济和适用于现场推广应用等优点，作为一种新的血清学诊断方法具有较强的推广价值［22］。

3.7RNA探针检测方法

RNA探针方法以其较高的特异性而广泛用于目前动物疫病检测中。rRNA的一些基因存在于所有的副结核分枝杆菌中具有高度的同源性，检测时有明显的交叉反应，而某些基因具有明显的种属特异性。利用具有特异性的rRNA标记成rRNA探针就是检测副结核分枝杆菌的基础［23］。该方法的优点是特异性好，结果较为可靠。

3.8聚合酶链式反应技术（PCR）

随着现代分子生物学技术的发展，聚合酶链式反应技术（PCR）也逐步用于动物疫病病原的检测工作中。在副结核分枝杆菌的检测过程中，目前的研究热点是细菌的插入序列IS900［15］。IS900由1 451个碱基组成，G+C的含量为66%，具有明显的特异性［4，24］。利用IS900的某些片段标记为DNA探针，结合套式PCR技术可以特异性的检测出动物粪便中的细菌［25］。目前国外对这方面技术的研究，尤其是如何消除假阳性和假阴性因素的研究有了很全面的介绍。由于副结核分枝杆菌为无细胞壁的细菌，所以分离培养十分困难，一般常规培养细菌需要6周以上的时间且步骤十分繁琐，而使用PCR技术检测细菌只需要几个小时，能够快速、敏感、特异地检出病料中的细菌，对于副结核病的控制具有十分重要的应用价值，是目前诊断副结核病的理想方法［26］。由于PCR方法比其他方法具有更高的检出效率，并且克服了其他常规方法耗时、敏感性不强等缺点，有望成为检测副结核病的一种实用而可靠的手段［27-28］。

4　防治措施

4.1综合性防治措施

因病牛往往在感染后期才出现症状，因此用药物治疗的实际意义较小。预防本病主要是加强饲养管理，尤其要注意幼年牛的营养补充以便增强抵抗力。如从疫区引进牛只则必须进行健康检查才能混群。对曾有过病牛的假定健康牛群，随时做好观察、定期进行临床检查，对所有牛只每隔3个月做一次变态反应，变态反应为阴性的牛方可调出，连续3次检查为阴性的牛可视为健康牛。对变态反应和临床症状明显的排菌牛，应隔离分批扑杀。被污染的牛舍、栏杆、饲槽、用具、绳索、运动场要用生石灰、来苏儿、氢氧化钠、漂白粉、石碳酸等消毒液进行喷雾、浸泡或冲洗，粪便应堆积高温发酵后作肥料［29］。

4.2疫苗免疫接种

欧美一些副结核病流行严重的国家由于流行面广、感染率高，承受不了检出扑杀的巨大经济损失。这些国家通过长期的论证认为，对新生犊牛进行免疫接种、配合必要的兽医卫生措施是控制本病的最有效措施［30］。但因犊牛的接种免疫效果不佳以及接种牛对变态反应呈阳性等问题，未能在世界各国推广。副结核病是在幼龄期感染的，并存在较高的垂直传播，因此仅靠主动免疫防止感染较为困难。在实际应用中，副结核疫苗只是抗临床发病，不能彻底清除排菌牛。另外接种副结核疫苗的牛对结核菌素和副结核菌素皮内变态反应都呈阳性，对识别结核病牛造成困难，从而影响牛结核病的检疫，只有几个国家使用此方法。目前使用的疫苗有两种，一是弱毒疫苗，一是灭活疫苗。英国及一些东欧国家一般采用弱毒活疫苗，而美国、挪威等国家使用灭活疫苗［31］。

5　公共卫生影响

近年来由于奶牛和肉牛业发展迅速，生产规模逐渐扩大，集约化程度越来越高，牛的流动范围也随之加大，副结核发病呈上升趋势，需要重点关注。当前一些劣质奶及其乳产品的出现，人类免疫抑制性疾病的发病率逐渐增高，加剧了牛副结核病的潜在危险，也使人克罗恩病的发病率增大。要更好地预防副结核病的发生需要定期检疫、处理或隔离病牛并采取相应的卫生消毒措施，对具有明显临床症状的开放性病牛和细菌学检查为阳性的病牛，要及时捕杀处理，防止细菌继续扩散。同时要加强食品卫生的检疫力度，及时发现并淘汰劣质牛奶，争取将其影响控制到最小程度［32］。

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Progress in the Epidemiological Characteristics and Diagnosis Technology of Bovine Paratuberculosis

Sun Yu，Ma Shichun，Wang Xiaoying，et al
（China Animal Disease Control Center，Beijing102600，China）

Bovine paratuberculosis is a zoonosis caused by mycobacterium paratuberculosis，which was characterized by chronic hyperplastic and intractable enteritis and progressive weight loss.Clinical symptom and pathological change of the disease is intractable diarrhea，progressive weight loss，chronic granulomatous ileitis，intestinal mucosal thickening and the formation of wrinkles.Diagnosis methods of paratuberculosis include clinical symptoms，while a final diagnos is depended on laboratory diagnostic methods，such as etiological diagnosis，serological diagnosis and molecular biological diagnosis.It results in considerable economic losses to the stock farming.Because of the long latence，easy transmissibility and the limitations of culture，so strengthening of the awareness of disease etiology and epidemiology is very important to comprehensive prevention measures of paratuberculosis.The author mainly introduced the research progress on pathogen，epidemiology and diagnosis technology of paratuberculosis.In addition，the advantages and disadvantages of various mothods were compared，in order to provide scientific basis for a further study and rapid diagnosis of paratuberculosis.

bovine paratuberculosis；epidemiology；laboratory diagnosis

S858.23

A

2095-3887（2015）02-0044-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.02.014

2015-02-04

公益性行业（农业）科研专项（201403052）

孙雨（1983－），男，兽医师，博士。

王晓英（1963－），女，研究员。研究方向：动物疫病预防控制。