PCR技术在畜产品安全检测中的应用

马艳荣（新疆维吾尔自治区阿克苏地区动物疫病控制诊断中心 843000）

PCR技术在畜产品安全检测中的应用

马艳荣（新疆维吾尔自治区阿克苏地区动物疫病控制诊断中心 843000）

随着世界经济全球化、贸易自由化和农产品国际贸易的迅速发展，畜产品安全已成为事关人民健康和构建和谐社会的重大战略问题，及时、安全、准确地检测出农产品中的病原微生物是农产品安全检测的重要内容。随着畜产品分析物质的不断微量和痕量化，畜产品基质的不断复杂化，仅使用传统分析技术已难以解决所有的问题。

1 PCR在肉中致病微生物检测的应用

加强畜禽肉和水产品的检验检疫，保证其食用安全，是预防食源性疾病暴发的重要途径。PCR技术有快速、特异、敏感等特点，因而该技术在肉食品中致病菌的检测方面具有很大的应用潜力。部分常见食源性病原微生物的PCR检测已有相应的商品试剂盒出售。大量研究表明，PCR技术在对食品中病原微生物的确证试验方面与传统培养方法相比至少具有相同的灵敏度，而多数情况下则表现出更高的灵敏度，而且检测周期大为缩短。建立荧光PCR方法、实时PCR方法、多重PCR等方法可简便、快速、灵敏地实现对肠出血性大肠杆菌，单增李氏菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的细菌学诊断快速、简便、经济，有较大的应用价值。

随着分子生物学技术的不断发展，多重PCR、标记PCR、不对称PCR等多种不同的PCR方法都被应用于畜产品检测中，它们的应用使PCR技术拥有了更高的灵敏度和更短的周期。

2 PCR在鲜肉及肉制品肉的种属来源鉴定的应用

随着社会经济的快速发展，消费者对食品质量与安全性的要求也越来越高，席卷欧洲 “马肉风波”、疯牛病、禽流感等疾病的出现以及宗教、经济健康原因和市场监管，都急需一种快速、准确的检测方法以对肉制品、宠物食品和肉骨粉等所含肉的成分进行种属鉴定。当前，对研究者、消费者、食品工业和政策制定者等各个方面来说，食品的真伪都是一个热点问题，尤其是肉类工业。PCR技术具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速高效等特点，在肉类掺假检测方面具有巨大的应用价值。目前所采用的感官检验和免疫学方法可鉴别生鲜肉的种属，但对热加工处理的肉类，由于其感官性状、蛋白质成分和其他免疫原性物质被破坏而难以鉴别，因此熟肉种类与饲料中牛羊肉成分的种属鉴别一直是亟待解决的难题。

动物品种的鉴定方法主要从蛋白和核酸两个层次进行。以蛋白为基础的方法主要包括十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS PAGE）等电聚焦电泳和免疫学方法。以核酸为基础的方法包括物种特异引物多重PCR、荧光PCR、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）等。

20世纪80年代，国外开始对肉的种属鉴定进行研究，初期的研究对象主要是生猪肉和牛肉。采用的方法主要有DNA杂交、免疫扩散和等电点聚焦等。这些方法中，DNA杂交和免疫扩散灵敏度高。但DNA杂交试验方法复杂，耗时长；免疫扩散不能够检测出有亲缘关系的肉类品种，比如山羊与绵羊，水牛与普通黄牛。同时对经过加工的制品检测效果不佳；等电聚焦速度快，但灵敏度稍差，成本高，工作量大且不易准确定量。

物种鉴定的关键因素是选择合适的分析基因。肉类食品在加工过程中经过加热、高压、辐射等处理后，DNA发生断裂，提取的DNA减少。Arslan A研究证实，烹煮、烘烤、压力处理、油煎等烹饪过的牛肉制品通过提取其线粒体中271bp的DNA片段，而后经过PCR扩增也可以鉴别出来，但是高温的非水烹调肉可能用PCR无法检测，因为高温使肉碳化、DNA变性。

目前用于肉类食品成分鉴定的基因通常位于线粒体（mtDNA）上，包括细胞色素 b（Cytb）基因、12SrDNA、16SrDNA、D-loop基因等。T.Matsunaga等（1999）利用Cytb来设计引物扩增基因片段，并将山羊、鸡、牛、绵羊、猪和马的基因混合，正向引物（Forward primer）在Cytb的保守DNA序列上设计，反向引物（Reveserprimer）采用几个物种各自特有的DNA序列来进行多元PCR反应，所得的扩增片段可用于鉴别几种物种。高琳（2008）等以动物线粒体DNA中Cytb区段的保守序列为目的基因进行PCR-RFLP，从6种生肉及7种加工肉制品中鉴别出猪源性和牛源性成分。所有样品经PCR扩增均产生359bp的片段。扩增子采用Alu I限制性酶切所产生的片段差异可用于区分猪肉和牛肉。

肉骨粉是牲畜屠宰后其毛纤维、皮革、角质、骨骼、脏器等非食用组织经由高温蒸煮后再挥干水分的成品，是重要的动物蛋白饲料，在养殖领域使用极为广泛。目前国内外已经建立了许多从饲料里鉴别动物源性成分的方法，其中以PCR方法最为灵敏和准确。李文静等分别运用特异性引物，针对牛、羊、猪和鸡的线粒体基因中的某一片断进行扩增，建立了鉴别四种动物源性成分的PCR方法，用每种动物的特异性引物跟其它动物的DNA进行PCR扩增，结果没有扩增出非特异条带，说明选用的牛的引物和自己设计的三种引物都具有特异性，检出的牛肉骨粉的最低含量约为0.001%。证明该方法具有快速、灵敏度高和特异性强等优点，可以作为鉴定肉骨粉种类的常规方法。

综上所述，PCR方法以其快速、灵敏、操作简单、节省费用等特点逐渐成为质检部门检测的主要方法，PCR方法尤为突出的优点在于解决了传统方法的困难，使致病微生物的检测，熟肉、熟肉制品的种类鉴定成为可能，为市场肉类管理、动物检疫、刑侦等提供了快速、可靠、方便的手段。

马艳荣（1981.1-），女，汉族，大学本科，兽医师，从事兽医实验室检测工作。