Doxycycline对胃癌细胞增殖与侵袭的影响

赵然 王学哲 李红 王鹏

Doxycycline对胃癌细胞增殖与侵袭的影响

赵然 王学哲 李红 王鹏

目的探讨多西环素(Doxycycline)对胃癌SGC7901细胞抑制增殖和侵袭能力的影响, 分别检测跨膜受体蛋白(Notch-1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达的情况, 并对其可能的机制进行初步探讨。方法通过对胃腺癌SGC7901细胞培养及干预, 分别以终浓度0、5、10、15、20 μg/ml的Doxycycline作用于人胃癌细胞SGC7901, 用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT 法)检测Doxycycline对胃癌细胞的细胞抑制率；采用瑞士姬姆萨混合染色液进行染色, 显微镜下观察细胞形态学变化；流式细胞法检测肿瘤细胞的凋亡率及增殖周期的影响；Transwell小室法检测细胞侵袭能力的变化；Western blot法检测Notch-1, MMP-9蛋白表达的变化。结果Doxycycline能够诱导胃腺癌细胞SGC7901的凋亡, 存在时间-剂量依赖性(P＜0.01)；能够改变细胞周期的分布, 随着Doxycycline浓度的增加, G0/G1期细胞所占比例增加, S期细胞比例减少, G2/M期细胞比例减少；随着药物浓度的增加, Notch-1和MMP-9蛋白表达增加(P＜0.01)。结论上调Notch-1可能是Doxycycline能够抑制人胃腺癌SGC7901细胞的增殖和侵袭的机制之一。

多西环素；胃癌；增殖；侵袭；跨膜受体蛋白；基质金属蛋白酶-9

胃癌在我国居恶性肿瘤第三位, 据全国肿瘤登记地区数据表明, 2009年胃癌发病率为36.21/10万, 死亡率为25.88/10万。肿瘤细胞增殖和凋亡平衡失调导致了肿瘤的生成。临床上多选择用抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡两种方法来达到肿瘤的治疗目的［1］。Doxycycline属于四环素族抗生素, 除具有抗菌性能, 大量医学研究证明, 对肿瘤细胞也具有细胞毒活性和抗增殖作用。Doxycycline的优点是持续的时间较长、毒性相对较少, 有较强特异性, 对各种癌细胞均有细胞毒性和抗增殖作用, 它已经被证明能够抑制细胞的增殖和侵袭以及诱导细胞凋亡［2］。

1 材料与方法

1.1 材料 胃腺癌SGC7901细胞由北京大学人民医院提供。

1.2 药物与试剂 MTT及凋亡检测试剂盒 (北京赛驰生物公司)、胎牛血清、胰蛋白酶、RPMI-1640 培养基(美国Gibco公司)、Doxycycline(Sigma公司)、Notch-1抗体(ABCAM公司)、瑞士姬姆萨混合染色液(美国BD公司)、MMP-9抗体(Santa Cruz公司)、碘化丙啶(PI)染色液、70%乙醇。

1.3 方法 37℃温度下, 饱和湿度, 5%CO2的条件下, 将胃癌SGC7901细胞培养于 10%胎牛血清RPMI1640培养液中进行传代培养。应用MTT法。选择对数生长期的细胞, 用0.25%胰酶制备成单细胞悬液, 调整密度为1×106/ml, 接种到96孔培养板, 每孔接种100 μl。根据浓度不同分为五组:药物终浓度为0、5、10、15、20 μg/ml组。加入RPMI 1640培养基作为对照组, 每一浓度设6个复孔。培养24、48、72 h, 用酶联免疫检测仪在570 nm处测定吸光度值, 细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组平均 OD 值/对照组平均OD值)× 100%。

Western blot检测MMP-9的表达：将各组细胞在培养7 h后进行收集, 分别提取总蛋白, 进行聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶电泳, 转膜, 10%脱脂牛奶室温封闭3 h, 加入抗MMP-9(1：500)、和β-actin (1∶200)4℃ 下孵育, 摇床过夜, 加二抗室温下孵育2 h, 用化学发光剂显色, 自动电泳凝胶成像分析仪采集图像, 显示蛋白的表达水平。

1.4 统计学方法 实验数据采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示。多组间均数比较采用单因素方差分析及重复测量资料的方差分析, 组间多重比较采用SNK-α检验, 相关性比较采用Pearson相关分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

Doxycycline对细胞增殖抑制的影响 在24、48、72 h对细胞增殖抑制率：①0 μg/ml组：为基线对照均为0；②5 μg/ml组：(20.01±1.55)、(28.98±1.72)、(35.02±1.27)%；③10 μg/ml组：(32.02±1.29)、(42.09±1.45)、(48.92±1.34)%；④15 μg/ml组：(48.72±1.63)、(53.98±1.09)、(60.24±1.06)%；⑤20 μg/ml组：(54.92±1.45)、(60.15±1.23)、(68.92±1.63)%。各组浓度的Doxycycline对胃癌细胞的增殖都有抑制作用,并且这种抑制作用与Doxycycline存在着时间-剂量相互关系, 即随着Doxycycline药物浓度的增大和作用时间的延长, Doxycycline对胃癌细胞增殖的抑制作用更加明显。各浓度组细胞增殖抑制率与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；相同作用时间下, 各浓度组之间细胞增殖抑制率的差异均有统计学意义(P＜0.05)；相同浓度作用下, 不同作用时间的细胞增殖抑制率的差异均有统计学意义(P＜0.05)；24 h、48 h、72 h的IC 50值分别为12.86、10.88、9.07。

3 讨论

胃癌在我国居各种癌症死亡的第三大病因。肿瘤细胞的过度增殖与阻碍凋亡, 直接导致了肿瘤细胞生命的延长。肿瘤细胞增殖和凋亡平衡失调导致了肿瘤的生成。临床上多选择用抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡两种方法来达到肿瘤的治疗目的。Doxycycline对各种癌细胞均有细胞毒性和抗增殖作用［3］, 能够抑制细胞的增殖和侵袭以及诱导细胞凋亡［4］。原发和继发肿瘤的生长调节效应, 促进新生血管形成和调节细胞粘附等［5］。

综上所述, Doxycycline对于胃癌的治疗有较强的临床应用潜力, Notch1的激活可能为机制之一。

［1］郑朝旭, 郑荣寿, 陈万青.中国2009年胃癌发病与死亡分析.中国肿瘤, 2013, 22(5):327-332.

［2］许敏, 李红.强力霉素对胃癌细胞增殖及Notch1、MMP-9表达的影响.天津医药, 2014, 42(6):533-535.

［3］谢兆兰, 朱尤庆, 林小玲, 等.强力霉素对胃癌细胞SGC-7901基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶组织抑制因子-2表达的影响.胃肠病学, 2006, 11(4):202-206.

［4］刘曼丽, 邹文进, 黄明汉, 等.多西环素对体外培养的牛角膜肌成纤维细胞增生的影响.中华实验眼科杂志, 2013, 31(5): 428-433.

［5］刘斌, 徐小方, 关素敏, 等. PTEN基因联合多西环素对黏液表皮样癌细胞侵袭的抑制作用.口腔医学研究, 2010, 26(5):617-619.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.21.027

2015-08-04］

121001 辽宁医学院附属第一医院检验科

王学哲