超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱法快速鉴别生晒参中的皂苷类成分

张晓旭 王洪平 杨 阳 杜茂波 毛 森 陈 畅 刘玉欣 李韶菁.河北大学药学院，河北保定 0700；.中国中医科学院中药研究所，北京 00700；.中国中医科学院，北京 00700；.北京中医药大学东直门医院，北京 00700

超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱法快速鉴别生晒参中的皂苷类成分

张晓旭1，2王洪平2杨 阳3杜茂波2毛 森4陈 畅2刘玉欣1李韶菁2
1.河北大学药学院，河北保定 071002；2.中国中医科学院中药研究所，北京 100700；3.中国中医科学院，北京 100700；4.北京中医药大学东直门医院，北京 100700

目的 采用超高效液相色谱与串联四极杆飞行时间质谱联用技术，快速全面鉴别生晒参中人参皂苷类成分。方法色谱分离采用Agilent Zorbax RRHD Eclipse Plus C18色谱柱；流动相为水（含0.1%甲酸，A）和乙腈（含0.1%甲酸，B），梯度洗脱。质谱定性采用高分辨飞行时间质谱，电喷雾双喷离子源（Dual AJS ESI），负离子模式。 结果11 min内对生晒参中的95个皂苷类成分进行了鉴别。结论本研究为目前生晒参的质量控制提供了可行的依据。

人参；人参皂苷；超高效液相色谱；四极杆飞行时间质谱

人参为五加科植物人参（Panax GinsengC.A.Meyer）的干燥根，是我国名贵中药材，被《神农本草经》列为上品，有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津、安神的功效，是常用的滋补强壮药，在《中华人民共和国卫生部药品标准—中药成方制剂》（《中药部颁标准》）收录的4000余种中成药中，含人参的处方就达到307个，占到了近1/10[1]。因此为保证人参药材质量，许多学者对其主要药效成分人参皂苷进行了较为深入的研究，取得了一些进展[2]，一些微量的人参皂苷逐渐被分离和分析出来[3]，但全面反映人参中皂苷类成分的组成、快速辨识其中的皂苷类成分却少有报道。超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）联用技术具有高分离度、高灵敏度和高分辨率等特点，可通过化合物的精确分子量推测分子式信息，并结合二级质谱的碎片离子推断其化学结构组成，近年来已逐渐被用于复杂中药化学成分的研究[4]。本研究选取生晒参为研究对象，采用UPLC-Q-TOF-MS/MS法，对其皂苷类成分进行了快速全面的分析鉴别。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

Agilent 1290超高效液相色谱仪 （美国Agilent公司），配有在线脱气机，四元泵，自动进样器，柱温箱和二极管阵列检测器；Q-TOF 6540质谱仪 （美国Agilent公司），配有Dual AJS ESI离子源，分析软件为Mass Hunter Data Acquisition在线工作站和Qualitative Analysis离线分析软件；N-1100型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DFT-50型粉碎机 （温岭市林大机械有限公司）；BP211D型天平（赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.1.2 药品与试剂

人参皂苷20（S）-F1、20（S）-F2、Rb1、Rb2、Rb3、Rd、Re、Rg1、Rg3对照品购自中国食品药品检定研究院；人参皂苷Rc、Rf对照品购自北京世纪奥科生物技术有限公司。乙腈、甲醇和甲酸（Fisher，美国）为质谱级；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。生晒参药材购自吉林省宏久和善堂人参有限公司，经中国中医科学院中药研究所孙伟博士鉴定为五加科植物人参（Panax Ginseng C.A.Meyer）的干燥根。

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液的制备

1.2.1.1 对照品储备液 分别取12种对照品人参皂苷20（S）-F1、20（S）-F2、Rb1、Rb2、Rb3、Rd、Re、Rg1、Rg3、Rc、Rf适量，精密称定，用甲醇溶解并定容至5mL容量瓶中，浓度为200 μg/mL，于4℃储存备用。

1.2.1.2 对照品混合液 分别精密吸取以上各对照品溶液适量于5 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，使每个对照品的终浓度为10 μg/mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

1.2.2 供试品溶液制备

称取药材粉末（已过40目筛）1.0 g，置具塞三角烧瓶中，加入70%甲醇10 mL，超声提取30 min，过滤，残渣继续加70%甲醇10 mL，继续超声提取30 min，共提取3次，合并滤液，于40℃旋转蒸发仪浓缩至干，残渣用70%甲醇溶解并定容至5 mL容量瓶中，经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

1.2.3 色谱条件

Agilent Zorbax RRHD Eclipse Plus C18色谱柱（100 mm×3 mm，1.8 μm），流动相由水（含0.1%甲酸，A）和乙腈（含0.1%甲酸，B）组成，梯度洗脱：0～3 min，5%～30%B；3～5 min，30%～35%B；5～8.5 min，35%～42%B；8.5～10 min，42%～95%B；10～11 min，95%B；进样量：2 μL；流速：0.8 mL/min；柱温：45℃；分流比：1∶1。

1.2.4 质谱条件

采用Dual AJS ESI离子源，负离子模式。扫描范围：m/z 100～1700；干燥气温度：300℃；干燥气流速：5 L/min；雾化器压力：35 Psig（1 Psig=6.895 kPa）；鞘气温度：400℃；鞘气流速：12 L/min；毛细管电压：3500 V；毛细管出口电压：280 V；喷嘴电压：1500 V；碰撞能量：50、55、60 V；参比离子：m/z 119.0363和1033.9881。

2 结果

2.1 生晒参药材基峰离子图

乙腈-水作为流动相使人参皂苷类成分得到了良好的分离，经过分流后以0.4 mL/min的流速进入到质谱系统中，得到较好的电喷雾电离状态和最小化的离子抑制效应[5]。根据“1.2.1”项下的样品处理方法处理样品，并根据“1.2.3”和“1.2.4”项下的色谱质谱条件进样，生晒参供试液中的人参皂苷成分在11 min内得到良好的分离，共识别了95个色谱峰，药材基峰离子图见图1（A）。

2.2 利用对照品鉴别化合物

通过与对照品的保留时间及碎片离子信息比较，共11个化合物被鉴定：人参皂苷Re（峰11）、Rg1（峰12）、Rf（峰30）、Rb1（峰42）、Rc（峰46）、Rb2（峰51）、Rb3（峰52）、20（S）-F1（峰60）、Rd（峰64）、20（S）-F2（峰92）、Rg3（峰94），人参皂苷混合对照品的基峰离子图见图1（B）。

2.3 皂苷类成分的裂解途径及主要特征性化合物的鉴别

皂苷类成分经过超高效液相的分离，大多数人参皂苷在一级质谱ESI负离子模式下形成[M-H]-和[M+ COOH]-的准分子离子峰，其中丙二酰基化人参皂苷和齐墩果烷型人参皂苷为酸性皂苷，主要以[M-H]-准分子离子存在[6]。二级质谱中，皂苷类成分经过碰撞诱导解离（CID）而产生糖苷键的断裂，最后生成特征性的去糖基化离子。因此可根据去糖基化离子的母核结构，推断皂苷的结构类型。人参皂苷的常规裂解方式及途径见图2。

人参皂苷根据糖苷基结构，可分为四环三萜类的达玛烷型和五环三萜类的齐墩果烷型；达玛烷型根据四环母核上羟基的有无，又分为人参二醇型和人参三醇型。根据质谱的技术原理，同一类型的化合物有相同或相似的裂解规律，因此鉴别不同类型人参皂苷的特征性成分，是辨识与其有类似结构人参皂苷的前提。

在基峰离子图中，峰26的二级质谱中有特征性碎片离子m/z 459.3884的存在，显示此化合物为人参二醇型皂苷。其在一级质谱中产生m/z 1269.6447的[M-H]-分子离子峰，推测其分子式为C60H102O28。母核连接的糖苷键断裂，生成了[M-H-162]-、[M-H-324]-、[M-H-486]-、[M-H-684]-和[M-H-810]-的去糖基化离子和一些糖离子。根据图3（A）的裂解途径及图4中人参皂苷的结构组成，此化合物被鉴定为人参皂苷Ra0。

同理得出峰37为人参三醇型三七皂苷R2，峰62为齐墩果烷型竹节参皂苷Ⅰva。经过能量碰撞，母核上连接的糖苷键断裂，生成[M-H-（Glc+H2O）]-、[M-H-（Xyl+H2O）]-等去糖基化离子和糖离子，如m/z为131.0354的[Xyl-H2O-H]-、m/z为161.0448的[Glc-H2O-H]-等，见图3（B，C）。

2.4 丙二酰基人参皂苷的鉴别

丙二酰基人参皂苷是鲜人参和生晒参中人参皂苷的主要存在形式，其特征性的酰基键极不稳定，易脱羧[13]，因此常作为人参原材料质量控制的重要指标[6]，然而目前对丙二酰基人参皂苷指纹图谱鉴别的文献较少。本文在总结前人研究的基础上，鉴别了丙二酰化人参皂苷，以期为生晒参的质量评价提供依据。本研究鉴别出的17个丙二酰人参皂苷中，其一级质谱图均能见到[M-H]-准分子离子峰和[M-H-CO2]-的碎片离子峰；其中的3个二丙二酰基人参皂苷，其一级质谱除能检测到[M-H]-准分子离子峰和[M-H-CO2-CO2]-的碎片离子峰外，尚能检到[M-H-CO2]-碎片离子峰。峰65、峰70对应的Ma-Rd和2Ma-Rd的ESI/MS图谱见图5。

2.5 生晒参药材中皂苷类成分的鉴定结果

人参皂苷类成分有大量的同分异构体，如[M-H]-为m/z 769.47的有峰37、峰38、峰39，根据文献参考[2]，再由于3者的极性不同，在色谱柱中的保留时间有所差异，推测3个成分分别为三七皂苷R2、人参皂苷F3和伪人参皂苷RT3。同理推测出竹节参皂苷Ⅰva（峰62）、姜状三七苷R1（峰91）[14]，人参皂苷Ra2（峰35）、人参皂苷Ra1（峰47）[15]。

一级质谱中[M-H]-均为m/z 783.49的峰27、峰92、及峰94，参照对照品的保留时间和质谱离子特征，推测出峰92、峰94分别为人参皂苷F2、人参皂苷Rg3，峰27的糖苷元离子为m/z 475.3723，为人参三醇型皂苷，推测为人参皂苷Rg2[5]。同理推测出峰11、峰64、峰77分别为人参皂苷Re、人参皂苷Rd和绞股蓝皂苷ⅩⅦ[2]。

根据精确分子量、特征碎片离子、相对保留时间及参考相关文献，本研究在11 min内鉴别出95个皂苷类成分，包括m/z 459.3838的二醇型人参皂苷（峰26、峰28、峰31等52个）、m/z 475.3787的三醇型人参皂苷（峰3、峰5、峰6等28个）、m/z 455.3603的齐墩果烷型人参皂苷（峰45、峰57、峰62等8个）、m/z 491.3737的达玛烷型衍生物（峰 4、峰24）和 m/z 475.3787的达玛烷型衍生物（峰1、峰10、峰15）及其他（峰34、峰40），质谱定性分析及鉴定结果见表1。

3 讨论

实验采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术测定生晒参中人参皂苷类成分，通过该法提供精确的分子质量，得到可能的分子式组成，并参考碎片离子等，在11 min内鉴定出生晒参的95种皂苷类成分。生晒参中的皂苷类成分中存在有大量的同分异构体，受飞行时间质谱原理的局限性，不能对同分异构体进行准确判定。本文通过比对对照品，考察特征性碎片及母核结构，结合相关文献保留时间及出峰顺序，对部分人参皂苷的同分异构体进行了鉴别，未判定的同分异构体有待进一步研究。

本实验实现了快速全息化的鉴别，为进一步研究人参药材的物质基础和质量评价奠定基础，同时对中药多成分尤其是微量成分的辨识也具有重要意义。

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Rapid analysis of ginsenosides in dried fresh Ginseng by ultra-performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight mass spectrometry

ZHANG Xiaoxu1,2WANG Hongping2YANG Yang3DU Maobo2MAO Sen4CHEN Chang2LIU Yuxin1LI Shaojing2
1.College of Pharmacy,Hebei University,Hebei Province,Baoding 071002,China;2.Institute of Chinese Materia Medica,China Academy of Chinese Medical Science,Beijing 100700,China;3.China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China;4.Dongzhimen Hospital of Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100700,China

ObjectiveTo identify the saponins components from dried fresh Ginseng by ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry rapidly and comprehensively.Methods Chromatographic separation was achieved on an Agilent Zorbax RRHD Eclipse Plus C18column.The mobile phase was consisted of 0.1%formic acid water(A)and 0.1%formic acid acetonitrile(B)with a gradient program.Qualitative analysis was performed on an Agilent 6540 quadrupole time-of-flight spectrometer mass which equipped with a Dual AJS ESI source operating in negative mode.Results A total of 95 ginsenosides in dried fresh Ginseng were identified only in 11 minutes.Conclusion This study provides a feasible basis for the quality control of the dried fresh Ginseng.

Panax Ginseng;Ginsenosides;UPLC;Q-TOF

R284.1

A

1673-7210（2015）03（c）-0130-07

2014-12-11本文编辑：卫 轲）

国家科技重大专项“重大新药创制”项目（编号2014ZX09304307001、2012ZX09103201-055）；国家自然科学基金资助项目（编号81303261、81274133）；中国中医科学院中药研究所基本科研业务费自主选题项目（编号ZZ2014060、ZZ2014005）。

刘玉欣（1956-），男，博士，教授，主要从事细胞及分子药理学研究；李韶菁（1974-），女，博士，副研究员，主要从事中药组效关系及分子药理学研究。