利用NOD小鼠构建I型糖尿病模型的研究进展



利用NOD小鼠构建I型糖尿病模型的研究进展

万继亚，刘岩厚，王轶楠*

(吉林大学第一医院转化医学研究院，吉林 长春130061)

I型糖尿病(Type I diabetes，TID)是由遗传因素和环境因素共同介导产生的自身免疫性疾病，以自体激活的T淋巴细胞对分泌胰岛素的胰岛β细胞的进行性破坏为特征，最终导致胰岛素不足、血糖调节异常、持续高血糖状态和相关并发症出现，是一种复杂的代谢性疾病。流行病学研究表明，TID占糖尿病患者总数的10%左右，每年全球增长率约为3%[1,2]。该文主要就应用基因调控NOD小鼠构建人TID动物模型，从胰岛β细胞保护机制、自身免疫性T细胞活化调控机制、诱导外周耐受机制、以及利用模拟人TID的免疫系统人源化小鼠模型，针对人免疫细胞靶点的治疗方案开发等方面加以综述。

1利用NOD小鼠构建TID模型概况

在构建TID动物模型的早期阶段，主要是通过非免疫学机制(如手术或药物)导致胰岛β细胞损伤，产生胰岛素分泌障碍、持续高血糖状态等类似糖尿病的症状。常用药物有四氧嘧啶(Alloxan)和链脲佐菌素(Streptozotoein，STZ)，这两种药物引起β细胞损伤的机制虽然不同，但主要都是通过诱导产生大量的氧自由基造成β细胞损伤，动物都有血糖升高，血糖降低，持续高血糖三个时相的变化，但模型制备的成功与否受很多因素影响，如动物选择、给药剂量、给药途径等；并且此类模型虽然能够引起高血糖等症状，可用于研究高血糖所引起的并发症，但并不能反映TID真正的发病机制。

1980年Tochino等通过近亲交配和选择繁殖获得了一种纯系的自发性非肥胖糖尿病(nonobese diabetic，NOD)小鼠,其发病特征和病理学变化与人的糖尿病很相似[3]。雌性NOD小鼠在3周龄时开始出现自身免疫性胰岛炎，伴有巨噬细胞、DC以及B、T淋巴细胞胰岛内浸润，12至16周龄开始因严重胰岛β细胞破坏而出现糖尿病症状，在30周龄时发病率可达到60%-80%；雄性NOD小鼠在稍晚期发病，发病率在20%-30%左右。组织学研究显示，糖尿病出现症状前，胰岛先有大量的淋巴细胞浸润，开始分布在胰岛细胞周围或部分胰岛细胞内，以后逐渐蔓延到腺管和血管周围，胰岛β细胞肿胀、排列紊乱、细胞数目逐渐减少，以至在后期完全消失。免疫组织化学研究提示胰岛浸润的细胞主要为T淋巴细胞。

NOD小鼠对于糖尿病的基因易感性是由多个基因位点决定的，其中最为重要的是独特的MHC单倍体H-2g7，由于Ea基因启动子区域的缺失，这一单倍体不表达I-E分子，而是表达I-A分子[4]。与人类糖尿病易感基因同样，NOD小鼠的糖尿病易感基因属于MHC的II类分子。进一步研究发现NOD小鼠的TID也是由T细胞介导的，B细胞在此过程中作为抗原提呈细胞发挥作用，而不是介导体液免疫反应。基于NOD小鼠糖尿病的自发性、发病率的稳定性、相似的病理学改变和遗传学基础，以及相似的免疫学发病机制，利用NOD小鼠构建TID模型已经广泛深入的用来探讨人TID的发病机制及临床诊疗手段的开发。

2胰岛β细胞保护机制的研究

在TID的发生发展过程中，胰岛β细胞的损伤是由不同的免疫细胞多重浸润造成的，抗原提呈细胞，如巨噬细胞、DC等分泌炎性介质(TNF-α、IFN-γ、IL-1β和活性氧自由基等)诱导胰岛炎症的发生和胰岛β细胞的损伤；进而这些抗原提呈细胞处理自身抗原并提呈给T细胞，诱导细胞介导的免疫反应，通过释放各种细胞毒性因子，如炎性细胞因子、颗粒酶、穿孔素等选择性杀伤胰岛β细胞；还可以通过Fas途径直接诱导胰岛β细胞的死亡[5,6]。各种基因调控NOD小鼠已被用来构建TID模型研究胰岛β细胞损伤的机制及防治策略。

2.1　调控效应T细胞功能保护胰岛β细胞的研究

效应T细胞介导胰岛β细胞的机制主要包括炎性细胞因子的分泌、FasL-Fas信号通路诱导的细胞凋亡、颗粒酶、穿孔素的分泌等[7,8]。有研究发现lpr突变Fas缺失的NOD小鼠不产生糖尿病症状，患病小鼠细胞转输也不能诱导发生糖尿病，表明在胰岛β细胞损伤中FasL-Fas途径很重要[9]；因此有研究者构建了胰岛素启动子调控的胰岛β细胞过表达FasL的NOD小鼠，发现这种小鼠出现较重的糖尿病，并对效应T细胞敏感性增强，推测在胰岛炎过程中产生的细胞因子可能诱导了胰岛β细胞表面Fas的表达，与转基因的FasL发生交联，从而导致对胰岛β细胞自身的自杀性攻击效应[10]。

T细胞活化需要双重信号，首先是T细胞受体识别MHC复合体提呈的特异性抗原肽，其次还需要共刺激分子的参与。正面的共刺激信号促进T细胞增殖和细胞因子的分泌，负面的共刺激信号诱导T细胞发生耐受[11]。在研究胰岛中浸润的效应T细胞功能调控中，研究者构建了胰岛β细胞特异性的由胰岛素启动子调控的过表达各种相关基因的NOD小鼠，发现负向调节分子PD-L1(Programmed death-1)的过表达会降低糖尿病的严重程度，抑制糖尿病的进展[12]。

2.2　调控细胞因子网络保护胰岛β细胞的研究

在TID发生发展过程中，促炎性细胞因子和Th1细胞分泌的细胞因子与疾病进展密切相关，而抗炎性细胞因子，如IL-4、IL-10、TGF-β等则有保护作用。研究者构建了多种胰岛特异性细胞因子转基因NOD小鼠，以期阐明各种细胞因子在胰岛微环境下对于胰岛β细胞和浸润的淋巴细胞的不同作用。研究表明，在胰岛素启动子下游过表达IL-4、TGF-β会抑制NOD小鼠胰岛炎和糖尿病的发生[13]。胰岛局部产生的IL-10加速糖尿病的发生、延长维持时间，而系统性应用IL-10则会有效防止糖尿病的发生，提示除了免疫抑制效应外，IL-10可能还有其他生物学作用，并且这些作用与IL-10分泌的时间、部位、受其影响的细胞类型都密切相关[14,15]。IL-35是IL-12家族的成员，研究表明IL-35具有抑制效应性T细胞的作用，胰岛β细胞上IL-35的过表达会减少NOD小鼠胰腺中T细胞的浸润和局部增殖，防止糖尿病的发生[16]。

2.3　调控趋化因子网络保护胰岛β细胞的研究

在炎症过程中，趋化因子能够募集炎性效应细胞到达局部并发挥免疫活性，在TID发展进程中，树突细胞、巨噬细胞、炎症部位的胰岛细胞都能够分泌趋化因子，引起胰岛局部淋巴细胞的大量浸润。研究表明，在胰岛局部通过异位表达趋化因子的受体中和趋化因子的作用，可以减轻淋巴细胞的浸润，防止糖尿病的发生。胰岛中炎性趋化因子的伪受体D6的过表达能够有效减少效应T细胞在胰岛部位的集聚，进而抑制T细胞活化造成的损伤[17,18]。

因此，应用NOD小鼠构建TID模型，通过在胰岛细胞特异性表达免疫调节分子，将有助于深入阐明在TID的发生发展过程中，淋巴细胞募集到胰岛局部，发挥免疫杀伤效应的机制，并有助于免疫治疗策略的设计和开发。

3TID自身免疫机制的研究

NOD小鼠的糖尿病易感基因属于MHC的II类分子，在糖尿病的发生发展过程中，自体活化的CD4T细胞发挥重要作用。为明确TID发病的自身免疫机制，由易感基因H-2g7提呈的多种胰岛自身抗原反应性T细胞被克隆鉴定，并建立了相应的T细胞受体库，进而构建多种T细胞受体转基因小鼠。应用自体反应性CD4T细胞克隆BDC2.5构建的T细胞受体转基因小鼠在三周内即可发生胰岛炎，要明显早于野生型的NOD小鼠，但并不显示出糖尿病的易感性，只有将其构建于NOD/SCID品系后，四周龄小鼠就会发生严重的胰岛炎和糖尿病[19]。

CD8T细胞缺陷的小鼠不会发生胰岛炎和糖尿病表明CD8T细胞同样参与胰岛β细胞损伤。为明确TID自身免疫机制中CD4T细胞与CD8T细胞的相互作用，胰岛特异性CD8T细胞克隆NY8.3被用来构建转基因NOD小鼠，这种小鼠与非转基因NOD小鼠相比较早发生糖尿病的症状，将NY8.3转基因构建到RAG2缺陷，没有CD4T细胞的NOD背景小鼠之后，糖尿病的发病率明显降低，发病晚于对照组小鼠，表明CD4T细胞在自身免疫性糖尿病发病中的优势作用[20]。

糖尿病抗原特异性T细胞受体转基因小鼠除了可以进行自身免疫机制的体内研究，也可以分离足够数量针对某个特异性抗原的原始T细胞，体外观察其在不同因素影响下的向Th1、Th2、 Th17、Treg等方向的分化情况，阐明CD4T细胞在糖尿病中的作用机制。然而，基于糖尿病抗原的多样性，应用单一一种抗原特异性CD4T或CD8T细胞受体的转基因小鼠对于体内免疫机制的研究也有其过于简单化的局限性，需要结合多种因素进行结果的综合判断与分析。

4TID外周免疫耐受机制的研究

TID是由遗传因素和环境因素共同影响的自身免疫性疾病，以外周免疫耐受被打破，T淋巴细胞发生针对自体抗原的免疫反应为重要特征，因此TID外周免疫耐受机制的研究对于TID的免疫治疗方案的开发非常重要。体内的自体活化T细胞在中枢由胸腺中发生的负选择机制诱导凋亡来排除，在外周主要由发挥免疫调节作用的细胞来对抗其作用[21]。

为研究TID外周免疫耐受机制，研究者构建了多种胰岛特异性表达外来抗原的转基因NOD小鼠，这些小鼠胰岛β细胞表面外来抗原的表达(主要是病毒蛋白成分)并不会诱导T细胞介导的对胰岛细胞的破坏，然而，当应用相关病毒感染这些小鼠时，外周耐受将会被打破，从而产生针对胰岛β细胞的破坏，发生糖尿病[22]。TID的发生已经被证明与病毒感染密切相关，如肠病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、细小病毒等。其中在糖尿病患者体内，最常见的病毒是属于肠病毒的柯萨奇病毒，这种病毒会感染多种组织，导致严重的胰岛炎，并最终通过分子模拟机制或旁观者效应激活T细胞，诱导自身免疫性糖尿病的发生[23]。这样，在TID的发病中，抗原提呈细胞的成熟和活化状态也是外周免疫耐受打破的重要环节。因此，应用NOD小鼠构建转基因模型，可以深入探讨环境中的病毒感染、基因变异和个体免疫反应等多种因素对于TID发病的共同作用机制。

5人源化MHC转基因小鼠

糖尿病的基因学研究已鉴定出与糖尿病易感性密切相关的60个以上的基因位点，超过90%以上的糖尿病患者都拥有独特的MHC型别。与NOD小鼠的MHC单倍体H-2g7类似，人类的糖尿病易感基因位点为MHC-II类分子HLA-DQ8。以明确的疾病基因易感性为基础，研究者构建了多种人源化MHC转基因小鼠，深入探讨了特异性T细胞受体/抗原肽/MHC分子的相互作用在疾病发展中的影响机制。

DQ8转基因NOD小鼠中CD4+T细胞绝大多数为DQ8限制性T细胞，可用来鉴定相对应的与自身抗原特异性结合的T细胞表型。除了DQ8基因位点之外，DR4也是重要的糖尿病易感基因位点，并与DQ8呈现明显的连锁不平衡现象。为解析这两个疾病易感基因位点在TID中的作用，Wen等人构建了DR4、DQ8转基因NOD小鼠，发现DR4转基因小鼠、DR8、DR4共同转基因表达小鼠的TID发病率显著低于DQ8转基因小鼠，显示DR4分子对于DQ8的糖尿病易感效应可能起到负调节的作用[24]。这些人源化MHC转基因小鼠能够促进疾病易感性MHC分子相应的自身抗原的鉴定，促进了TID分子机制的阐明和疾病预防相关的基因预测方案的开发[25]。

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(收稿日期：2014-07-02)

文章编号：1007-4287(2015)07-1234-03

*通讯作者