NOD1和NOD2介导的信号通路研究进展

郑 媛安 丽仇 杰施 玮.济南市中心医院儿科，山东济南 5003；.山东大学医学院，山东济南 5003；3.济南市中心医院妇产科，山东济南 5003

NOD1和NOD2介导的信号通路研究进展

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1.济南市中心医院儿科，山东济南 250013；2.山东大学医学院，山东济南 250013；3.济南市中心医院妇产科，山东济南 250013

[摘要]NOD样受体是一类新型胞浆内的固有免疫模式识别受体，在自身免疫调节中起重要作用，一旦被激活，这些分子触发细胞内信号通路，导致激活转录反应，最终在一个炎性基因子集上表达。在本文中，我们将专注于NOD1 和NOD2在识别和响应细胞内的病原体(包括革兰氏阳性和革兰氏阴性菌)的作用，以及它们在非肽聚糖含有病原体（例如病毒和原生动物寄生虫）的信号应答。

[关键词]NOD1；NOD2；胞内病原体；固有免疫

▲通讯作者

固有免疫系统能够识别多种致病微生物，是机体防御病原微生物的第一道防线。它通过特殊的模式识别受体（PRRs）感知病原体相关分子模式来识别入侵的病原体。它们可以被含有PRR的免疫细胞识别，进而启动免疫应答[1]。模式识别受体目前发现至少4种[2]，主要包括膜表面的Toll样受体家族（Toll like rectors，TLR）、胞浆内NOD样受体家族（NLR）、C型植物血凝素受体（C-type lectin receptors，CLR）、RIG样受体（retinoicacid inducible gene like helicase，RLH）。

1 NOD1和NOD2的结构与功能

NLRs家族主要含有3种共同结构域[3]：N端胱冬酶募集域（caspase recuriment domain，CARD）或神经原性细胞凋亡抑制蛋白结合域；位于NLR分子中间起到活化和寡聚化作用的NACHT结构域；C端的亮氨酸重复序列（LRRs）。所以根据NACHT结构域不同，NLRs家族可分为几个亚类：NLRPs，NODs，NAIP，IPAF和CIITA。NOD（nucleotide oligomerization domain）蛋白可以识别细菌肽聚糖（peptidoglycan，PGN），活化核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB），并诱导炎症反应。

NOD1和NOD2是固有免疫的胞质受体，能感知革兰氏阴阳性菌的肽聚糖。它们的功能已被广泛研究[4-6]，揭示了它们在宿主防御病原体起到关键作用，如单核细胞增多性李斯特菌，幽门螺杆菌，葡萄球菌等。在人体中，NOD受体，特别是NOD2受体的变异所致的NOD信号通路失调与炎症性肠病——克罗恩病有关。NOD通路的异常活化还会导致Blau综合征或早发的肉瘤样病变，两者都是以家族性肉芽肿性关节炎及皮肤肉芽肿为主要特征[7]。

2 NOD的稳定性、自身抑制及降解

NOD通过NACHT和LRR结构域以及细胞伴侣的相互作用使其在细胞内保持未激活、自身抑制的构象。Hahn[8]最早提出了NOD1与伴侣蛋白——热休克蛋白90（HSP90）相互作用，热休克蛋白90通过与某些植物R蛋白类似的方式为维持NOD1稳定性。Silva Correia等[8]将假说延伸应用到NOD2上。他们应用HSP90 SiRNA及一个小分子的HSP90抑制剂——格尔德霉素（geldanamycin）实验显示了HSP90在MCF-7细胞（人乳腺癌细胞）中维持NOD1和NOD2稳定性的重要性。该实验组接着研究了另一个R蛋白活性调节因子——SGT-1的作用。当SGT-1与NOD1和NOD2结合，SGT-1只对NOD1的细胞因子信号通路表现作用，且通过SiRNA敲除SGT-1基因不影响NOD1和NOD2的稳定性。其后，Mayor等[9]通过实验表明了SGT-1和HSP90对NOD2信号通路同样重要，虽然该实验是通过限制了格尔德霉素对胞壁酰二肽（MDP）激活的信号通路的抑制作用间接表明的。

Lee等[10]重复了HSP90与NOD2关系的实验，证明了HSP90对维持NOD2稳定性的重要性。在该实验中，HSP90作为负反馈调节的一部分，NOD2的激活导致负反馈调节从HSP90处中断并继发蛋白酶体依赖性降解。HSP90的作用再次由小分子抑制剂的应用得到证明，而蛋白酶体抑制剂MG-132阻断了NOD2的降解[10]。同时负反馈调节从HSP90处中断表明其包含了结合NOD2的MDP诱导蛋白——SOCS3，该蛋白至少部分参与NOD2的泛素化并引发了蛋白酶体性降解。SOCS3 和HSP90都与NOD2的CARD结构域结合，所以两者可能是互斥的复合体，且有假设认为SOCS3可将NOD2与某至今未知的E3连接酶相连接，参与该过程的E3连接酶可能为TRIM27，有报道认为TRIM27对NOD2的泛素化及降解起重要作用[11]。

3 NOD2配体的识别

NOD2是肽聚糖MDP的真正的胞浆受体。诱导MDP进入胞浆可通过多条通路实现，包括多肽载体SLC15A1，3，4；侵袭性细菌肽聚糖脱落，如福氏志贺菌；以及吸收革兰氏阴性菌释放的囊泡[12]。

近期研究[13]通过生物物理和生物化学方法表明MDP直接与NOD2相互作用。普遍认为，识别作用由NOD2的LRRs结构域介导。NOD2也可进行自我活化，该过程在由于NOD2多态性造成的罕见常染色体显性的炎症性疾病Blau综合征中可以得到检测[14]。造成Blau综合征的NOD2单核苷酸多态位点集中在NOD2的两个区域——核苷酸/Mg2+结合位点及位于NACHT和LRR结构域间的HD1。这间接表明了NOD2自我活化的发生机制可能是由于干扰了核苷酸的结合和水解，或者是干扰了分子伴侣的结合以及NOD2的NACHT、HD1及LRR之间的分子内联系。

4 NOD2与适配蛋白RIP2

RIP2是目前研究最多的与NOD2相互作用的蛋白质，RIP2在NOD1和NOD2的下游NF-kB通路及MAPK通路的活化中起重要作用。虽然RIP2在NOD通路的重要性已被证明，但RIP2与NOD1、NOD2相互作用过程中仍存在许多问题，其在MAPK通路及自噬作用中发挥的确切作用，其激酶结构域的用途及其多种翻译后修饰的作用。

RIP2的结构由N端的激酶结构域、中央连接区及C端的CARD构成。NOD2的两个CARD结构域共同过表达是激活下游的NF-κB通路所必须的，但CARD结构域独立表达时无法激活。所以单独的NOD2的CARD结构域无法RIP2结合，并且任何一个CARD结构域的某个特殊位点发生变异都无法与RIP2结合并阻断NF-κB信号通路[15]。根据报道称能与RIP2结合的最小的NOD2中的区段为NOD-2S[16]，该区段包括CARDa和CARDb的前三个螺旋结构。尽管可与RIP2结合，但NOD-2S的过表达并无法激活NF-κB通路。由此，该检测表明RIP2与NODs结合并不足以完成NF-κB的激活，这与近期关于NOD1与RIP2的研究结果一致[16]。实际上，RIP2介导的NOD2信号通路可能需要：以特定的构象聚合的复合体；翻译后修饰；NOD2的CARD结构域自身的相互作用或其他必要蛋白质的结合。虽然NOD1和NOD2的CARD结构域表现出自身的相互作用，但至今这些相互作用的生理学相关性尚未明确。

5 NOD2信号通路中RIP2的翻译后修饰的重要性

RIP2的磷酸化多发生在暴露在外的可变形区域。RIP2激酶结构域内的两个磷酸丝氨酸残基为S168和S176，位于RIP2晶体结构内的未知区域，且在RIP1和RIP3的晶体结构内不存在同源性残基。通过大规模的激酶组分析探测到的两个磷酸丝氨酸——S363和S393位于RIP2中间结构域靠近Y381的区域内。同时，Y520位于CARD结构域预测终端的边缘的两个脯氨酸残基之间，且RIP2可变形的C端区域包含四个已知的磷酸化位点——S527，S529，S531及S539。

近期研究表明[17]，至少五种E3连接酶参与RIP2的泛素化，包括ITCH，cIAP1，cIAP2 ，XIAP 及Pellino3。由cIAP2、XIAP和Pellino3介导的RIP2泛素化增强了NF-κB和JNK信号通路，而由ITCH介导的RIP2泛素化减弱了NF-κB信号通路但增强了JNK和MAPK磷酸化。K209被认为是RIP2泛素化的一个重要位点[18]，但与该泛素化相关的E3连接酶尚未明确。K209残基在RIP1和RIP4中保守存在并可能在这些蛋白质中起类似作用。

6 NOD1和NOD2在细菌感染中的作用

研究认为NOD1和NOD2的功能特性是识别肽聚糖的细胞内受体[19]。这些研究表明NOD1对革兰阴性菌敏感，而NOD2对革兰阳性菌和革兰阴性菌都敏感。

NOD1和NOD2识别致病菌的作用，在相应目标基因沉默的突变鼠上被进一步证明。NOD2功能的初步研究[20]是使用NOD2基因敲除鼠进行的，其是通过在第二个CARD域的第一部分重编码第一个外显因子制成的。令人惊奇的，尽管从这些小鼠获得BMDMs没有回应MDP刺激，这些小鼠并没有表现出明显的肠功能紊乱，从而形成了 NOD2的功能缺失[20]。随后，另外两个NOD2转基因鼠被设计：一个是在LRR域末端植入基因突变码，另一个是在Card15位点植入突变基因。Pauleau 等[21]报告显示，在正常光照与喂养情况下，这两种方法培育出的小鼠均没有显示出肠道疾病。

虽然NOD2-/-鼠没有显示出任何肠道炎症，研究证实它增加了细菌感染的易感性。对于李斯特菌感染，NOD2在限制细菌繁殖上起到了重要作用。在感染幽门螺杆菌的NOD1-/-鼠上也观测到相似的特性。

在衣原体肺炎模型中[22]，NOD2和RIPK2对宿主反应极为重要；NOD2-和RIPK2-鼠感染衣原体后，一氧化氮生成减少，以及肺部中性白细胞聚集延迟。NOD1-/-鼠感染梭状芽胞杆菌中观测到肠道中性粒细胞募集缺陷，原因可能与CXCL1产物缺乏有关。

有报告称[23]，NOD1和NOD2通过协同的方式来调节特定病原体的反应。例如，NOD1和NOD2均敲除鼠的炎性因子有显著降低，且在沙门氏菌定植粘膜组织结肠炎的模型上有增加。而此表型在NOD1-/-和NOD2-/-单独敲除模型中没有被观测到。

Geddes K[23]也报道了NOD1和NOD2的协同作用。与单一基因敲除相比较，NOD1和NOD2都缺乏的鼠更易感染高致死性细菌，且介导的炎性因子水平更低。

另一项研究嗜肺军团菌的报告显示[24]，NOD1 和NOD2显著的促进了炎性反应。与野生型鼠相比，NOD1-/-鼠显示细菌清除下降、中性粒细胞聚集延缓以及炎性因子下降。与之相反，NOD2-/-鼠中性粒细胞水平和炎性因子上升。然而，在感染的下一个阶段，NOD1-/-和NOD2-/-鼠在肺部促炎因子显著提高 。总之，上述研究指出[25]，虽然NOD1/NOD2/RIPK2信号不是宿主抵御嗜肺军团菌的决定性因素，但是NOD1 和NOD2在机体识别细菌中起了参与作用。

7 NOD1和NOD2在原虫感染中的作用

综上所述，NOD1和NOD2在介导细菌感染方面的作用已被深入研究。而且，通过建立NOD1-/-和NOD2-/-模型鼠也印证了这一点。然而，最近的研究显示，NOD1和NOD2在宿主抵御寄生虫感染方面也起到了关键作用。

NOD2-/-鼠无法清除弓形虫感染，且死亡率与MyD88-/-鼠近似。NOD2显示参与了T细胞固有功能，而不是激活巨噬细胞系统。并且，NOD2-/-鼠不能激活IFN下游产物及促使Th1 淋巴细胞分化。

通过其他细胞内原生寄生虫的研究，例如伯氏疟原虫和克氏锥虫，表明NOD2不是宿主抵御这些寄生虫所必须的[26]。相比之下，NOD1在宿主抵御克氏锥虫过程中发挥了相应的作用。NOD1-/-鼠的巨噬细胞在接受刺激时NF-κB介导的下游炎性因子减少，且在IFN-y出现时限制T.cruzi炎症失效。即便在血清中细胞因子水平正常的鼠，NOD1-/-鼠也是高度易感染克氏锥虫，且与MyD88-/-鼠的水平类似。

虽然上述报告显示NOD1和NOD2可能识别非细菌性病原体，但还需要进一步的研究证实NOD1 和NOD2在缺乏肽聚糖成分中的病原体识别中的作用，以及判定NOD1和NOD2是否对病原体产生受体，或是否参与了其他固有免疫分子的信号通路。

8 讨论

NOD1和NOD2蛋白在宿主固有免疫反应中扮演了重要角色。尽管它们对宿主防御外来侵害具有无可争议的重要性，但其潜在功能下的特定机制尚未明确。本综述已指出，部分蛋白质只作用于NOD2信号通路，部分蛋白质不仅影响NOD2还影响NOD1信号通路。毋庸置疑，新发现的蛋白质将分为两类。区分NOD1和NOD2信号通路调节间的异同尤其重要。我们通过掌握影响NOD1或NOD2信号通路的蛋白质所发挥的作用，从而真正明白这两个相似的受体的信号激活和调节机制的差异。如果我们忽略了这些相关蛋白的作用和功能而只是关注于NOD2和RIP2之间的关系，我们可能会无视它们细微、独特的调节，从而影响对其作用过程的研究。

NLR可通过信号通路介导炎性因子的大量释放，并参与组织和器官的损伤。它们激活的免疫应答与临床上诸多疾病都密切相关，对NOD受体在先天免疫中的重要性的认识得到进一步加深。然而，目前仍有许多问题尚未解决，如NLR的信号转导更详细的机制是什么?NOD与RIPK它们之间的联系从结构上怎么解释?如何通过阻断NLR信号通路，以减少病原微生物对机体的炎性损伤? 通过对NOD1和NOD2在免疫功能方面更全面深入的了解，研究干预措施，将为诊断、治疗甚至预防感染性疾病、炎症相关性疾病、自身免疫性疾病等提供新的治疗思路。

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[中图分类号]R392

[文献标识码]A

[文章编号]2095-0616（2015）23-49-04

收稿日期：（2015-07-29）

Insights into the research progress of the NOD1 and NOD2 signalling pathway

ZHENG Yuan1AN Li1QIU Jie2SHI Wei3
1.Department of Pediatric,Ji'nan Central Hospital,Ji'nan 250013,China；2.Shangdong University School of Medicine，Ji'nan 250013,China；3.Department of Obstetrics and Gynecology,Ji'nan Central Hospital，Ji'nan 250013,China

[Abstract]NOD-like receptor is a new type of intracytoplasmic inherent immune pattern recognition receptors,which Play an important role in immune response.Once activated,these molecules trigger intracellular signaling pathways that lead to the activation of transcriptional responses culminating in the expression of a subset of inflammatory genes.In this review,we will focus on the role of NOD1 and NOD2 in the recognition and response to intracellular pathogens,including Gram-positive and Gram-negative bacteria,and on their ability to signal in response to nonpeptidoglycan-containing pathogens,such as viruses and protozoan parasites.

[Key words]NOD1;NOD2;Intracellular pathogens;Innate immunity