缺血性卒中体外模型建立

郭安臣，赵一龙，苏芳，李巍巍，王拥军，王群

缺血性卒中占全部卒中的60%～80%，是由于脑血液供应障碍引起缺血、缺氧，营养剥夺，导致缺血中心的坏死和缺血周边出现半暗带区。即便恢复血液供应，也会造成再灌注损伤，导致患者的病情继续加重。针对脑缺血损伤的主要措施是积极采取脑保护措施。基于脑保护研发的药物在临床前实验中均表现出明显的疗效，而临床试验却无法获得理想的结果，没有一种脑保护药物通过美国药品食品管理局的批准[1]。因此，从新的模型制作、新的药物发现和保护机制进行更深入的研究对缺血性卒中的研究和临床治疗有更重要的意义。本文就脑缺血体外模型的现状，制备方法进行综述希望对脑缺血的研究提供参考。

1 缺血性卒中体外模型

1.1 神经元 神经元一直被认为是中枢神经系统中最重要的细胞，神经元的损伤、功能失调甚至凋亡将直接导致神经功能的缺失，因此既往很多治疗脑血管病的神经保护药物都以保护神经元为目标，其中原代培养的神经元和神经元细胞系相比更是受到研究人员的重点关注[2]。

神经元损伤主要涉及下列机制：①兴奋性氨基酸的毒性作用脑缺血缺氧时大量兴奋性氨基酸，尤其是谷氨酸的暴发性释放，N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体过度激活，形成所谓的“兴奋毒性”，造成突触后神经元过度兴奋、溃变、坏死[3]。②细胞内Ca2+超载，发生缺血性卒中时，电压依赖性Ca2+通道开放，引起损伤性Ca2+内流，细胞外大量Ca2+内流入细胞内，此时的Na+流出细胞外，同时激活蛋白激酶C（protein kinase C）、磷脂酶C（phospholipase C）和磷脂酶D（phospholipase D）途径，导致花生四烯酸堆积，对神经元造成损伤[4]。③自由基生成增加。自由基是指最外层电子轨道上含有一个或多个未配对电子的物质。可分为两类：一类是由氧诱发的自由基称为氧自由基；另外一类是氧自由基与多聚不饱和脂肪酸作用后生成的中间代谢产物是脂自由基。氧自由基主要指O2-和-OH等，研究显示，自由基损伤以缺血后再灌注时为最重，可能由于溪流和滴流的供血携带了微量氧进入组织，为维持脂质过氧化程序提供条件，加重自由基损伤[5]。④炎症反应。已经证实，缺血损伤后产生组织炎症反应，表现在炎症因子上调，促黏附分子和黏附分子的表达增加。已知的致炎因子包括白细胞介素－1（interleukin-1，IL-1）、白细胞介素－6、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等；黏附分子包括细胞间黏附分子1、内皮细胞选择素、血管细胞黏附分子等[6-7]。小胶质细胞反应在大鼠全脑缺血标本也比较强烈，应激的小胶质细胞分泌IL-1β。动物实验显示，大脑中脑动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠局灶缺血区20 min内可见反应性小胶质细胞，缺血再灌注损伤后缺血中心区内充满小胶质细胞。这些实验提出抗炎治疗是神经保护措施的理论依据[8]。⑤细胞凋亡不仅在发育过程中，而且在疾病发生中越来越受到人们的重视，它可能参与肿瘤、老年性痴呆等神经退变性疾病、艾滋病等疾病发生[9]。以前的研究认为，脑缺血过程中的细胞死亡是一种被动的坏死，然而最近的研究提示，缺血缺氧可能诱发神经细胞凋亡[10]。实验发现，在缺血性损害的急性期及迟发性神经无损害期，凋亡细胞均存在，而在迟发性神经元死亡期以细胞凋亡为主。缺血性损害的急性期，凋亡细胞与坏死细胞并存，提示神经细胞凋亡与坏死均参与脑缺血急性期细胞损害，但各自程度与缺血损害的轻重有关。轻度缺血时坏死表现轻微，细胞凋亡成为细胞损害的主要形式。在迟发性神经元损害期，无论是轻度缺血还是重度缺血，细胞凋亡均是细胞丢失的主要形式。

1.2 神经胶质细胞 大脑由神经元和神经胶质细胞组成，生物的进化程度越高，胶质细胞在脑内细胞中所占的比例也越高，人脑内90%的细胞皆为胶质细胞。最新研究表明，神经胶质细胞在缺血性卒中的发病及治疗过程中发挥重要作用，成为治疗缺血性卒中的新靶点[11]。星形胶质细胞是脑内促红细胞生成素的主要来源，促红细胞生成素能够减少神经元的凋亡，降低兴奋性氨基酸毒性及一氧化氮（nitric oxide，NO）引起的细胞死亡。同时卒中后星形胶质细胞能够表达血管样表皮生长因子，这种血管样表皮生长因子有明显的神经保护作用，能够抑制迟发性细胞凋亡；且能够促进血管的再生，对缺血性卒中的康复有重要意义[12-14]。细胞移植实验表明，移植到脑内的星形胶质细胞能够高表达脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors）、血小板源性生长因子（plateletderived growth factors）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein）等，而星形胶质细胞可通过这些细胞因子发挥神经保护作用[15]。

1.3 血管内皮细胞与血脑屏障 缺血性卒中除神经元及神经胶质细胞发生病理生理性改变外，向大脑供血的血管壁的完整性也遭到破坏。血管壁由血管内皮细胞和基底膜构成，正常情况下血管内皮细胞释放活性因子，调节血管张力、凝血、纤溶功能及维持正常血压均有一定的作用，一旦血管内皮细胞和基底膜受到损伤，可使血小板黏附、聚集，导致血栓形成，而且受刺激的内皮细胞可释放促凝血因子参与外源性凝血过程，加速血栓形成[16-17]。

血管内皮细胞与基底膜、星形胶质细胞一起形成血脑屏障，血脑屏障能够阻止损伤因子进入脑组织，同时也阻止了神经保护药物进入脑组织发挥作用的可能性[18]。血管内皮损伤和缺血性卒中密切相关，目前对血管内皮细胞损伤的确切机制及防治方法尚未完全清晰，因此，进一步研究血管内皮细胞损伤的机制对治疗缺血性卒中有重要意义。

1.4 脑片模型 细胞培养虽然具备实验条件易于控制，方便操作，细胞的生物学特征明确，但是，由于脱离了体内环境，使其丧失了组织结构和细胞之间的联系以及与之相关的生化特性。为了更好地研究缺血性卒中后各种细胞的变化，探索缺血性卒中的发病机制，寻找更有效的治疗方法。有学者建立了脑片模型，它相对于原代脑内的各种细胞，脑片可在体外培养数周时间，能保留体内状态下的细胞构成，突触回路，受体分布，细胞间的相互作用和三维立体结构，具有正常和完整的突触通路、递质传递和电生理等功能；脑片培养排除了体内模型中血脑屏障（bloodbrain barrier）的干扰，可采用人工培养基或添加各种药物，易于控制培养环境[19]。

1.5 神经血管单元 尽管国内外研究者围绕缺血后神经元的损伤与修复机制进行了大量的研究并取得一定进展，但仍缺乏有效治疗方法。过去对脑缺血损伤研究大多局限在神经元本身，或者将大脑中不同的细胞群体和结构分割开来研究，忽略了大脑功能的整体性和不同结构间的相互作用。2003年，美国科学家Lo等提出脑神经血管单元的概念。神经血管单元这一概念的提出，为临床治疗缺血性卒中提供了新的靶点。“脑神经血管单元”是由微血管（这些血管的内皮-基质-星形细胞足突复合体是一个完整的部分）、血管周围的星形细胞突起及由这些突起所支持的神经元及轴突共同组成的复合体，包括神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、血管内皮细胞、血管周细胞、基底膜及细胞外基质[20]。

2 模型制备与干预方法

缺血性卒中体外模型制备主要涉及细胞培养与干预。现对常用细胞培养及干预方法做简要介绍。

2.1 体外细胞培养

2.1.1 经典原代神经元培养方法 多采用15～18 d孕龄的胎鼠或新生鼠，在无菌条件下取材、机械分离、酶消化等步骤获得细胞悬液，接种至包被多聚赖氨酸的培养皿内，用添加B27的Neurobasal无血清培养基培养，并用阿糖胞苷抑制胶质细胞生长，可获得纯度较高的原代培养神经元，培养7～10 d后用于实验[12]。

2.1.2 经典原代星形胶质细胞培养方法 经典原代星形胶质细胞培养方法是由McCarthy 和Vellis于1980年建立的。胶质细胞原代培养的取材过程与神经元原代培养类同，只是培养时换成利于胶质细胞生长的杜尔伯科极限必需培养基（Dulbecco minimum essential medium，DMEM）完全培养基（含10%胎牛血清），体外培养l0～12 d后细胞融合并分层：上层主要为小胶质细胞，下层主要为星形胶质细胞。通过不同时间的水平摇动，使得小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞得以纯化，并应用于相关实验[22]。2.1.3 原代内皮细胞培养 一般从成年动物大脑皮质取材，剪刀破碎成1 mm大小，胶原酶消化后，经密度梯度离心或过筛方法获得，然后接种至Ⅳ型胶原包被的培养板内，培养4～5 d后融合形成紧密连接的单层细胞[23]。

而建立体外血脑屏障模型，则需要同时培养血管内皮细胞和星形胶质细胞，将两种细胞分别培养在Transwell细胞小室的上下层，通过测试通透性和跨内皮电阻（transendothelial electrical resistance，TEER）判断血脑屏障模型的完成情况。进一步利用血脑屏障模型进行药物及其他试验[24]。

2.1.4 脑片制备 脑片制备多采用出生后6～8 d的乳鼠。低温麻醉后，用75%的乙醇浸泡消毒，断头取脑，迅速转移至预冷的人工脑脊液中，用振动切片机进行切片，切片厚度为200～400 μm。整个过程要无菌。脑片稳定过夜后可进行后续实验[25]。

2.1.5 神经血管单元制作方法 神经血管单元制作以Transwell培养小室为媒介，结合原代神经细胞培养技术及大鼠微血管内皮细胞培养技术，将神经元、神经胶质细胞、脑微血管内皮细胞培养在一个体系中，同一体系的三种细胞培养成熟后，从形态学、屏障特性、特征性蛋白表达水平及niche环境的变化对神经血管屏障进行研究[26]。

2.2 制备缺血性卒中体外模型的干预方法 缺血性卒中的主要病因是由于血栓阻塞血管造成缺血缺氧区域的细胞发生病变，因此有关制备缺血性卒中模型的干预方法适用于所有细胞模型。

2.2.1 缺血、缺氧 氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation，OGD）是使用低氧装置结合无糖、无血清培养基或是向无糖培养基中持续通入不含氧的混合气体（5%CO2+95%N2）来模拟缺糖、缺氧环境进行细胞培养。经缺血、缺氧处理一段时间后，再把细胞转移到正常氧浓度和含糖培养基条件下继续培养，以模拟细胞或组织缺血再灌注损伤的病理生理学过程。

2.2.2 兴奋毒性 一般采用谷氨酸或谷氨酸盐和NMD，NMDA等试剂。100 μmol/L的谷氨酸盐作用于皮质神经元5 min即可造成大量损伤。在损伤的基础上研究神经元损伤的机制，或者探索减轻损伤的方法。

2.2.3 自由基过度形成 自由基过度形成主要采用过氧化氢、叔丁基过氧化氢、2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐（AAPH）等模拟脑缺血和缺血再灌注产生的活性氧（超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等）所引起的氧化应激损伤。模拟脑缺血时自由基过度形成的微环境，从而进行抗自由基或神经保护研究。

2.2.4 炎症因子 对于体外培养的小胶质细胞或脑组织，可给予脂多糖诱导小胶质细胞活化，从而产生多种炎症效应：TNF-α等炎症因子的释放，激活诱导型一氧化氮合酶合成NO，下调谷胱甘肽的表达等，对揭示缺血性脑卒中的免疫机制有重要意义。

2.2.5 细胞内钙超载 钙离子具有重要的功能，静息状态下细胞内钙离子浓度约为100 nmol/L，比细胞外钙离子浓度低2万倍，这种跨膜浓度梯度差由多种机制维持，包括细胞膜对钙离子通透性的限制、主动排钙机制及细胞内钙潴留等。各种损伤因素导致细胞内钙离子浓度异常增加，可比正常时高出100～200倍，称为钙超载。钙超载后细胞内线粒体出现功能障碍，激活钙依赖性磷脂酶，释放对细胞有毒性的物质；升高钙调蛋白酶活性，导致细胞外钙离子向细胞内流动，引起细胞死亡。细胞钙超载模型可用咖啡因、氯化钾、NMDA等诱导。

目前在抗脑缺血的机制及药物筛选研究中，虽然整体动物模型比较接近于脑缺血病理状态，但是由于实验动物的个体差异较大，实验人员在制备动物模型时的技术水平不同，对实验结果容易造成影响。而且动物模型的制备有一定难度，损伤的均一性难以掌握，工作量大，周期长，花费高。而利用细胞模型则可以克服动物模型的不足。而且可以根据脑缺血病理生理机制中的不同进程，有选择地从不同角度选用不同类型的细胞模型，对于研究缺血性卒中的发病机制及大规模筛选药物有重要的意义。

1 Jeyaseelan K, Lim KY, Armugam A.Neuroprotectants in stroke therapy[J]. Expert Opin Pharmacother, 2008, 9:887-900.

2 Tuttolomondo A, Di Sciacca R, Di Raimondo D, et al. Neuron protection as a therapeutic target in acute ischemic stroke[J]. Curr Top Med Chem, 2009, 9:1317-1334.

3 Hazell AS. Excitotoxic mechanisms in stroke:an update of concepts and treatment strategies[J]. Neurochem Int, 2007, 50:941-953.

4 Bano D, Nicotera P. Ca2+signals and neuronal death in brain ischemia[J]. Stroke, 2007,38:674-676.

5 Allen CL, Bayraktutan U. Oxidative stress and its role in the pathogenesis of ischaemic stroke[J]. Int J Stroke, 2009, 4:461-470.

6 Grotta J. Lubeluzole treatment of acute ischemic stroke. The US and Canadian Lubeluzole Ischemic Stroke Study Group[J].Stroke, 1997, 28:2338-2346.

7 Dyker AG, Lees KR. Duration of neuroprotective treatmemt for ischemic stroke[J]. Stroke, 1998, 29:535-542.

8 Zivin JA. Factors determining therapeutic window for stroke[J]. Neurology, 1998, 50:599-603.

9 Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease[J]. Science, 1995,267:1456-1462.

10 Jacobson MD, Raff MC. Programmed cell death and Bcl-2 protection in very low oxygen[J].Nature, 1995, 374:814-816.

11 Shao W, Zhang SZ, Tang M, et al. Suppression of neuroinflammation by astrocytic dopamine D2 receptors via αB-crystallin[J]. Nature,2013, 494:90-94.

12 Zhao Y, Rempe DA. Targeting astrocytes for stroke therapy[J]. Neurotherapeutics, 2010,7:439-451.

13 Li Y, Liu Z, Xin H, et al. The role of astrocytes in mediating exogenous cell-based restorative therapy for stroke[J]. Glia, 2014,62:1-16.

14 Hines DJ, Haydon PG. Inhibition of a SNARE-sensitive pathway in astrocytes attenuates damage following stroke[J]. J Neurosci, 2013,33:4234-4240.

15 Jiang P, Chen C, Wang R, et al. hESC-derived Olig2+progenitors generate a subtype of astroglia with protective effects against ischaemic brain injury[J]. Nat Commun, 2013,4:2196.

16 Rajendran P, Rengarajan T, Thangavel J, et al. The vascular endothelium and human diseases[J]. Int J Bio Sci, 2013, 9:1057-1069.

17 Zhao YH, Yuan B, Chen J, et al. Endothelial progenitor cells:therapeutic perspective for ischemic stroke[J]. CNS Neurosci Ther, 2013,19:67-75.

18 Shah K, Abbruscato T. The role of blood-brain barrier transporters in pathophysiology and pharmacotherapy of stroke[J]. Curr Pharm Des,2014, 20:1510-1522.

19 Noraberg J, Poulsen FR, Blaabjerg M, et al.Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair[J]. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord, 2005, 4:435-452.

20 Lo EH, Dalkara T, Moskowitz MA. Mechanisms,challenges and opportunities in stroke[J].Nat Rev Neurosci, 2003, 4:399-414.

21 Pacifici M, Peruzzi F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells:a quick protocol[J]. J Vis Exp, 2012, 24:e3965.

22 McCarthy KD, de Vellis J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue[J]. J Cell Biol, 1980, 85:890-902.

23 Chen Z, Rubin J, Tzima E. Role of PECAM-1 in arteriogenesis and specification of preexisting collaterals[J]. Circ Res, 2010,107:1355-1363.

24 Sajja RK, Prasad S, Cucullo L. Impact of altered glycaemia on blood-brain barrier endothelium:an in vitro study using the hCME/D3 cell line[J]. Fluids Barriers CNS, 2014,11:8.

25 Adamchik Y, Frantseva MV, Weisspapir M, et al. Methods to induce primary and secondary traumatic damage in organotypic hippocampal slice cultures[J]. Brain Res Brain Res Protoc,2000, 5:153-158.

26 Xue Q, Liu Y, Qi H, et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons,astrocytes and microvascular endothelial cells of rat[J]. Int J Bio Sci, 2013, 9:174-189.

【点睛】

缺血性卒中体外模型对于研究发病机制，筛选神经保护药物，探讨治疗方案具有重要意义。