蛹虫草菌种退化的探讨*

胡秀彩，吕爱军

（江苏师范大学生命科学学院，江苏 徐州 221116）

〈综述〉

蛹虫草菌种退化的探讨*

胡秀彩，吕爱军**

（江苏师范大学生命科学学院，江苏 徐州 221116）

蛹虫草具有与冬虫夏草极相似的药理药效，可以作为冬虫夏草的代用品，但其菌株在继代培养过程中极易退化导致产量急剧下降，是影响行业发展的核心技术问题。对蛹虫草退化菌种形态学、遗传学及子实体变化，并对当前研究中存在问题及解决菌种退化的方法进行探讨。

蛹虫草；退化菌种；正常菌种

蛹虫草（Cordyceps militaris），与冬虫夏草（C. sinensis）具有极相似的药理作用，可作为冬虫夏草的代用品。蛹虫草菌粉在我国作为一类功能性食品，其有效成分主要是虫草多糖、虫草菌素、虫草酸、甾体等，其中虫草菌素是蛹虫草产生的一种重要次生代谢产物，具有细胞及体液免疫作用。虫草多糖由于其显著的免疫活性和抗肿瘤作用，已被国家食品药品监督局受理进入临床审评阶段[1]。

目前国内外对虫草属真菌的开发利用研究比较多，我国人工栽培蛹虫草技术已经成熟，并进入了产业化发展阶段，但在批量生产中的核心技术难题是菌种的严重退化和菌株退化的早期检测[2]。这是由于菌种在继代培养过程中退化比较频繁，不仅会导致蛹虫草产量的急剧下降，而且成为影响行业发展的核心技术问题，阻碍了蛹虫草栽培业的进一步发展。在菌类栽培过程中退化的蛹虫草菌种是可遗传的，其生理、生化和遗传过程极其复杂，成为蛹虫草批量生产过程中的核心技术难题，是生产技术人员迫切需要得到解决的问题[2-4]。解决蛹虫草菌种退化问题已成为国内外学者研究的焦点，而关于菌种退化遗传机理的研究尚未见报道[5]。

1 形态学变化

菌种筛选在人工栽培蛹虫草过程中，是一项费时、费力的工作，但经过筛选之后的菌种一般在使用半年到一年左右就会发生退化现象，退化的菌种不长子实体或只产生极少量子实体。实验发现菌种退化后，蛹虫草菌种退化的形态表现为菌落有角变现象，这是蛹虫草无性型多型现象的表现之一。退化菌种的子实体可孕部分有丰富的子囊壳，正常菌种多数子实体的可孕部分仅有少数或没有子囊壳[6]。研究表明子囊孢子后代群体不但群体之间在培养性状上有不同程度的差异，即使是来自同一子实体的不同子囊孢子菌株间在菌落颜色、质地、生长速率等性状上也存在一定差异，各自产生子实体能力表型也不尽相同。李光荣等[5]研究蛹虫草菌落形态的多样性与产子实体能力表型的观察，结果显示，原代菌株产子实体能力要比子代菌株未发生退化部分分离株和已退化部分分离株都强，原代菌落背面颜色为橙铬色的菌株易长出发育良好的子实体，所产子实体在形态上更接近野生蛹虫草，而角变株的子实体发生畸形。唐晓庆等[16]研究球孢白僵菌在继代培养中的菌落角变现象，认为菌种退化与菌落角变有着直接关系。李美娜等[7]研究表明退化菌株在菌丝体阶段就能从外部形态特征在显微镜下区分，退化菌株在培养时菌丝体见光之后不变色，镜检菌丝形态为菌丝纤细、弯曲，孢子粘连在一起呈头状；正常菌株在见光之后应逐渐变为橘黄色，镜检时菌丝粗壮、挺立，分生孢子呈念珠状。李琳等[8]用人工培养基研究发现，丝状真菌会发生高频率的退化现象。这些结果进一步证明，真菌角变显示出老化相关的典型特征，为真菌菌落退化研究指明了新的研究方向。

2 子实体变化

退化菌株与正常菌株相比，培养周期变长，子实体原基减少，产孢能力大幅度上升或下降，甚至子实体生长受阻[9]。Magae等[10]研究发现担子菌Flammulina velutipes的退化菌株在菌丝体中出现了双链RNA和病毒样粒子。Hemachandra等[11]发现NCIMB8052菌株的1种突变株C10，在基因中人为插入1种ISCb1序列能够延缓菌株退化。Chen等[12]通过对Clostridium beijerincki菌株核糖体DNA的分析发现，其退化菌株中没有辅酶A转移酶基因。李美娜等[7]研究分析了野生菌株与退化菌株的酯酶、苹果酸酶和细胞色素酶等8种同工酶的差异性，发现退化菌株的部分同工酶不表达或表达量很低；林清泉等[13]研究了蛹虫草退化菌株与正常菌株在色度、交配型、脱氢酶的活性和dsRNA感染等的特征差异性，结果表明，退化菌株在色度培养基中的脱色能力和脱氢酶活性都明显弱于正常菌株。

研究表明，蛹虫草只有同时具有2种交配型的单孢菌株才能形成子实体，而只有1种交配型的单孢菌株未能形成子实体，但交配型不同的2个单孢菌株可以通过配对杂交形成子实体。梁月等[24]分离了6个单子囊孢子群体，只有少部分的单子囊孢子株形成子实体，而大部分的单子囊孢子菌株未能形成良好的子实体。对于此现象，可能存在三种原因：一是交配型偏分离，食用菌中已有很多关于交配型偏分离现象的报道，在蛹虫草的培养过程中同样存在；二是同宗配合与异宗配合并存，测定蛹虫草的交配型后，提出蛹虫草是以两极性异宗配合为主的真菌，本质上是异宗配合真菌，但少数菌株进行自交配合形成子实体；三是交配型的转换，这可能与菌种某些基因的改变有关。

一些虫生真菌，如绿僵菌和白僵菌等也表现出类似退化现象。退化绿僵菌常表现为产孢量减少或者不产孢子、绒毛状菌丝的出现，甚至有些菌株在生长发育过程中形成不育扇形突变区，高氧化应激和线粒体DNA发生了一些改变[14-15]；而退化的白僵菌则表现出不同形式的菌落局部变化，比如菌丝生长率突变、菌株毒力下降和产孢量减少等现象。唐晓庆等[16]研究了球孢白僵菌在继代培养中的菌落角变现象，认为菌种退化与菌落角变有着直接关系。

3 遗传学变化

在实际生产中，优良蛹虫草菌株，随着菌种传代、转接次数的增加或保藏时间的延长，即使栽培条件没有变化，菌种也会表现出不分化子实体原基和畸形子实体增加等退化现象，表现在子实体产量和品质的下降，畸形率上升，甚至不形成子座。蛹虫草菌种的遗传背景因素是子实体能否正常发育的决定因素，其变化应该是导致菌种退化的根本原因。影响蛹虫草形成子实体的主要因素可以分为两个方面，一方面是培养条件与环境因素，另一方面是菌株的遗传背景因素，与正常菌种相比，退化菌种在遗传因素上发生了变异。蛹虫草是复型真菌，在它的生活史中以无性孢子（分生孢子）的形成为基本特征的无性生长繁殖阶段，称为无性型；以子座的形成并产生子囊壳和有性孢子（子囊孢子）为基本特征的有性繁殖阶段，称为有性型。在蛹虫草的繁殖过程中，菌种产生异核现象及其所导致的准性生殖是某些真菌遗传变异的重要原因之一。研究表明正常优良的蛹虫草菌种是以异核体形式存在的，而退化的蛹虫草菌种是以同核体形式存在的，所以蛹虫草菌种退化的遗传背景原因是核相发生了改变，即异核体变成了同核体。同核体仅含有其中的一类交配型基因，不能单独完成有性生活史，只有当可亲和的初生同核菌丝体之间发生质配后，形成含有两类交配型基因的异核体，才能完成有性生活史，具备形成子实体的能力[7-8]。

梁宗琦等[17-18]报道了蛹虫草无性型的多型现象方面研究，提出蛹虫草拟青霉无性型不仅是一种异核体，而且有可能是一种异粒体，这一独到的见解对于蛹虫草退化机理的解释是一大创举；在人工培养条件下，蛹虫草等虫草无性型为适应生存条件的改变，一方面通过某些营寄生性基因的丢失或钝化调整，另一方面通过孢子自身菌丝间的原生质、细胞颗粒和核的交换和/或重组而得到调整。真菌的多型性正是这类丢失、钝化、交换或重组过程的形态表现。李美娜等[7]利用PCR-RFLP和RAPD方法对野生驯化蛹虫草及其退化菌株进行基因水平的分析，发现野生驯化菌株与退化菌株在DNA水平上已产生明显的遗传变异，这种变异无论是在早期遗传检测，还是在突变机理研究中都有着十分重要的意义，这一研究对进一步深入开展真菌的遗传变异机理研究奠定基础，为梁宗琦等提出的理论在遗传物质分子分析中找到很好的证据。高新华等[19]研究了蛹虫草单孢子菌株配对后对子实体形成的影响，以及其与无性型产孢结构关系。薛建娥等[20]对蛹虫草人工培养种的分离与复壮进行了研究。陈永久等[21-22]用RAPD标记对青藏高原部分地区冬虫夏草进行分析，表明来自同一地方的样本遗传差异很小，地理群间遗传差异较大，且差异度与地理距离呈正相关。随后张云武等[23]用同样的方法对滇西北地区冬虫夏草、阔孢虫草和蛹虫草进行分析，表明同一地区的同种虫草差异较小，而地理群间和不同种的虫草间差异较大。

至今，针对蛹虫草菌种退化问题，主要尝试过以下三种解决方法：一是优化培养基，改进栽培条件；二是尽量减少转代次数；三是菌种复壮。蛹虫草退化菌种的形态学、遗传学及子实体变化等相关研究，仍然十分粗浅，目前国内外尚未能从根本上解决菌种的退化问题。

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Discussion of the Degenerate Strains of Cordyceps militaris

HU Xiu-cai,LV Ai-jun
(Jiangsu Normal University,Xuzhou 221116,China)

Comparing with the function pharmacology and drug effect,Cordyceps militaris was similar with Cordyceps sinensis，which had been provided substitution of Cordyceps sinensis.However,the degenerate subcultures of C.militaris had increasingly reduced the production of this economically important fungus.In this paper,the development progresses of Cordyceps militaris degenerate subculture in morphological,genetic and changes fruit bodies changes were summed up.At the same time,we prospect the current research existence questions and the technique solution of degenerate subculture.

Cordyceps militaris;degenerate subculture;wild strains of C.militaris

S646.9

A

1003-8310（2015）01-0001-03

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.01.001

江苏师范大学校科研基金重点项目（11XLA20）；国家自然科学基金（31272692）；江苏省“青蓝项目”（QL2014013）。

胡秀彩（1976-），女，硕士，实验师，主要从事资源微生物学研究。E-mail:huxiucai@126.com

**通信作者：吕爱军（1973-），男，博士，副教授，主要从事微生物及免疫学研究。E-mail:lajand@126.com

2014-11-10