微器官培养技术及其在前列腺癌研究中的应用

江 明黄月皎程 纯. 南通大学医学院基础医学研究室（南通 600）;. 南通大学附属肿瘤医院肿瘤内科; . 南通大学医学院免疫学系

·专家述评·

微器官培养技术及其在前列腺癌研究中的应用

江 明1黄月皎2程 纯3
1. 南通大学医学院基础医学研究室（南通 226001）;
2. 南通大学附属肿瘤医院肿瘤内科; 3. 南通大学医学院免疫学系

前列腺癌（prostate cancer, PCa）居西方国家男性中发生率的首位，也是第二癌症致死原因[1]。导致前列腺癌致死的主要临床原因是前列腺癌容易发生骨转移，骨转移的发生率占所有前列腺癌患者的80%以上[2, 3]。已有研究表明，前列腺癌骨转移与肿瘤细胞与微环境（microenvironment）的相互作用有关，骨组织的微环境富含细胞因子、生长因子、祖细胞和造血细胞等，组成了适合前列腺癌细胞转移的微环境，促进了肿瘤细胞的黏附、增殖、迁移以及存活[4]。最近5年来的研究已经证明，各种基因突变类型的前列腺癌具有一些共同的特征，美国食品药品监督管理局（FDA）批准的前列腺癌治疗药物也有了空前的发展。但是，关于前列腺癌基因突变的分子机制尚不明确，其相对应的有效治疗反应还不清楚。由于前列腺癌永生化细胞系很有限，尚不能很好地代表临床疾病的多样性，导致了体外研究模型的不足。由于前列腺癌组织建系困难，导致目前在现有公共细胞库中前列腺癌细胞系较少[5]。近年来陆续有关于前列腺癌体外微器官培养（organoid culture）新技术的报道，该突破性技术可应用于各种临床表型的前列腺癌样本进行肿瘤生物学特征和其与肿瘤微环境相互作用等研究以及临床抗癌药物筛选，实现个体化肿瘤治疗[6]。

一、肿瘤微器官培养技术的发展

在过去的30多年中，体外肿瘤模型的研究大多数是以单层二维肿瘤细胞培养的方式进行[7, 8]，很少是在三维模式中生长和形成组织器官样结构进行研究，其结果导致了与原发肿瘤组织存在结构和生物学特性方面的差异，所以不能够完全代表原发肿瘤的特点。微器官培养是在体外将器官和组织碎片扩增形成稳定的微结构并具有基本功能，而这一过程仅需几天时间[9]。在90年代，有报道关于一些肿瘤，比如肺和咽喉部肿瘤在体外微器官培养条件的研究[10]；近几年来相继有报道小肠、结直肠、胰腺、胃以及肝脏等组织在体外微器官培养条件的研究[11-14]。Karthaus等优化了人正常前列腺组织基底细胞和腺上皮细胞的体外微器官培养条件[15]；使用上述前列腺组织体外培养的特定条件，Gao等成功地建立了新型前列腺癌细胞株，保留了7种来自不同疾病发展阶段的人前列腺癌细胞系详细的分子表型，其中也包括循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC），这些新型细胞株可用于体内外的各种药物试验[16]。Karthaus等研究发现一种依赖于R-spondin1的微器官培养方法，能够使人或鼠的前列腺上皮细胞在体外长期增殖，因为前列腺基底细胞和腺上皮细胞均包含多潜能干细胞，在体外与大鼠泌尿生殖窦间充质（urogenital sinus mesenchyme, UGM）组织重组（tissue recombination）培养模型中，可使前列腺体组织再生和分化并保留完整的生物学特征，表明微器官培养技术在前列腺组织再生和前列腺癌发生、发展进程分子机制的研究中具有较好的应用价值[15]。

二、前列腺癌微器官培养技术

（一）细胞来源

应用于前列腺癌微器官培养的细胞来源不局限于已建立的细胞系，还可以是人和鼠前列腺组织的原代培养细胞、小鼠移植性前列腺癌细胞和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS）等。美国西奈医学中心应用人前列腺癌细胞株LNCaP和其对应的RANK基因敲减LNCaPRANKL和LNCaPNeo亚型细胞等进行研究[4, 17]；在Karthaus等成功原代培养人正常前列腺基底细胞和腺上皮细胞的基础上，Gao等运用微器官培养技术培养人类公共细胞库中包括循环肿瘤细胞在内的7株前列腺癌细胞系，这些细胞系包含了SPOP基因突变、PTEN基因丢失、TMPRSS2-ERG基因融合以及包含TP53、PIK3R1、FOXA1基因突变和多种染色质修饰改变的去势治疗无效的前列腺癌细胞系[16]。对前列腺癌病人组织样本原代培养，一般挑选具有特征性临床表现和预后的活检或手术新鲜样本。通过切取原发和小鼠移植的新鲜肿瘤组织，用含有四乙酸二氨基乙烷（ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA）的胰酶消化，然后收集原代细胞进行下一步的微器官培养[18, 19]。在小鼠前列腺微器官培养中，通常应用流式细胞仪将表达CD49f的基底细胞和表达CD24的腺上皮细胞进行分选；而在培养人前列腺组织时，常用CD49f标记基底细胞，用CD26或CD29标记腺上皮细胞来进行分选[4, 15]。iPS细胞具有分化潜能，可以分化形成各种细胞类型，其微器官结构形成的两个关键事件：严格的细胞挑选和保证细胞体系的一致性[20]。

（二）培养条件

进行小鼠前列腺癌微器官培养时，先将小鼠前列腺上皮组织降解，再混入特定细胞培养基质Matrigel，在其中增加常规的微器官培养介质，包含表皮生长因子（EGF）、Niggin和R-spondin1 （ENR）等[13]。Niggin为BMP抑制剂，在微器官形成的初期能明显地增加微器官的数目，并参与微器官的扩增；R-spondin1为Wnt信号通路抑制剂，在前列腺发育过程中，主要在泌尿生殖窦中表达，与前列腺细胞的增殖密切相关[21]；还可加入Alk3/4/5的抑制剂A83-01，可抑制TGF-β信号通路，防止中断前列腺细胞的增殖[22, 23]；通常还加入二氢睾酮（DHT），虽然不是必要的营养物质，但能明显增加微器官形成的效率[15]。根据Jung等的前期研究结果，在人前列腺组织微器官培养时需要在培养基质Matrigel中加入各种生长因子，如成纤维细胞生长因子2和10 （FGF2，GF10）及前列腺素E2（PGE2）， 这些生长因子已经证实有助于前列腺细胞系的增殖[24, 25]。在小鼠前列腺微器官培养中可加入的介质成分，即ENR、A83-01和DHT等[14]；Karthaus等在此基础上还加入了小肠微器官培养中的必需物质：尼克酰胺或称烟酰胺及p38抑制剂SB202190等[15]。

（三）培养结果

研究发现，前列腺多能干细胞和腺上皮细胞形成微器官的能力有明显的差别，多能干细胞相对于腺上皮细胞具有明显的高效率[26]。正常野生型小鼠和人体前列腺提取的多能干细胞，经过约一周的培养，单一的细胞可形成实体细胞团簇，在2～3周之内，形成显微镜下可见的微器官腺体结构，经免疫组化、免疫荧光等分析显示，形成的微器官结构由特异性表达CK5的基底细胞和表达CK8的腺上皮细胞共同组成[15]， 它们也分别特征性地表达其他一些基底细胞和腺上皮细胞的免疫标记，如p63、PSA、雄激素受体（androgen receptor，AR）等[6, 15]。

三、前列腺癌微器官培养技术的应用研究

（一）基因突变和表达谱检测

由于体外建立前列腺癌细胞株非常困难，导致缺少具有代表性的前列腺癌细胞系模型。人类公共细胞系库中前列腺癌细胞系较少，不能代表临床疾病谱，所以迫切需要建立新的具有临床表型共性的细胞系和模型以推动这一研究领域的进展。正常组织体细胞的培养在衰老之前仅仅经历数量有限的生物学信号通路，这个现象被称之为“海弗利克极限（Hayflick limit）”[27]。使用人工方法永生化细胞，可以恢复端粒酶的作用以突破这一限制，并活化p53和RB肿瘤抑制基因等信号通路[28]。最近，Clevers等发现在微器官培养体系中，正常人和小鼠的前列腺上皮细胞能被非永生化地无限期地培养[15]。这个体系已经被充分用于人转移性前列腺癌的培养，并且已经成功建立几个新的细胞系，这些细胞系能更加完整地代表临床疾病的表型[16]。

研究证实，Lgr5是Wnt通路的竞争性拮抗剂R-spondin的受体，在鼠和人的多种成熟器官中作为干细胞的标记，在R-spondin依赖的微器官培养体系中，那些Lgr5标记的干细胞能够分化并生长形成上皮样结构，仍然保持与原始器官组织基因表达的一致性[29]。近期发表的应用Matrigel作为培养基质和增加培养介质来研究良恶性前列腺微器官培养体系，其技术的关键突破点是该体系的培养介质能使良性和恶性的前列腺细胞无限地繁殖，而不需要人工转化，保持基因组图谱没有漂移，具有较高的建系成功率[15]。已建立的前列腺癌细胞系表达疾病特异性的基因突变，如ETS异位、SPOP突变、FOXA1突变和CHD1缺失等，其在该体外微器官培养模型体系中得以扩增[16]，对这些细胞系的持续培养和收集，可以发现更多的前列腺癌基因突变。

（二）肿瘤生物学行为研究

研究表明肿瘤细胞生物学行为受到周围微环境的强烈影响，尤其是受到支持组织和间质（即肿瘤微环境）的影响。不同类型支持细胞间复杂的相互作用影响正常和恶性细胞的增值、分化和新陈代谢等一系列生物学行为特性[30]。不同病人的肿瘤细胞在相同的原代培养条件下，可出现不同的生长形态和形态学表现，具有侵袭性生长方式的细胞，通常预示着该病人不良的预后[31]。Ranga等报道了利用上皮来源的肿瘤细胞在体外三维培养，可方便地应用于分析肿瘤侵袭、迁移和肿瘤血管生成的生物学特性[32]。已有三维培养实验结果表明，AR通过细胞与细胞外基质的相互作用进行调节；AR与整合素α2之间存在正反馈调节；前列腺癌细胞的增殖和存活依赖于p-Akt和p-FAK信号通路活化[4]。更改肿瘤细胞Matrigel微器官培养的条件，即改变细胞外基质中的组成部分，可应用于研究周围微环境的组成成分对肿瘤生物学行为的影响[33]。三维微血管培养的研究显示，几种血管生成抑制剂，如：激酶抑制剂和单克隆抗体等对其敏感；建立肿瘤细胞分泌血管生成素的三维培养模型，可使前列腺癌细胞在缺乏外源性生长因子的情况下继续生长[34]。

（三）药物实验

研究发现，传统的用于药物筛选的二维细胞培养模式被证明在药物浓度、体内复杂微环境的相互作用和实验结果的临床应用可靠性等方面存在着许多明显的缺点[30]。前列腺癌微器官培养技术可以初步解决这些问题，在一个富含生物性和相关物质的复合物的培养系统中，均一地和可扩增地培养大量前列腺癌细胞系，可应用于药物筛选和药物敏感性等体外药物相关实验。

1. 靶向药物：传统应用二维细胞培养体系是由于其相比于体内移植瘤模型具有易用性、重复性、低成本和高效益的优势。而恶性细胞与周围微环境的相互作用及其氧气、营养梯度和pH值等的差异，使体外二维细胞培养体系与肿瘤宿主体内的“真实世界”存在着明显的对药物应答敏感性的差异，这些差异对有效性治疗药物的筛选产生了障碍。微器官培养技术的成功应用，构成了包含大量良、恶性前列腺组织微器官培养细胞信息的“百科全书”，可在体外应用于临床疾病谱药物的筛选。这本“百科全书”记录了每一个微器官培养细胞详细的临床和分子生物学特征、疾病的特点、治疗的反应、突变的位点和基因表达谱等丰富的基本信息，可建立大数据平台，提供成本和时间最佳效益的治疗方法并应用于新药的研发，预测这项技术能够提供个性化治疗靶点和靶向药物合成的新思路[5]。

此外，循环肿瘤细胞（CTC）的体外微器官培养技术开启了一个非常令人兴奋的新的肿瘤诊治策略评估渠道，简单的抽血取代了有技术性挑战的转移位置的活检，避免了病人的痛苦。关于循环肿瘤细胞在转移灶中和在原发性肿瘤组织中的生物学特性，仍有争议，有待进一步的研究。最近有研究表明，可间接地培养循环肿瘤细胞来进行乳腺癌靶向治疗的筛选，这预示着循环肿瘤细胞微器官技术也可用于研究相关晚期实体器官的恶性肿瘤[30]。前列腺癌循环肿瘤细胞的应用也指日可待。

2. 药物疗效：医疗卫生监管机构要求在人类临床治疗试验之前必须进行动物实验，各种各样的肿瘤模型已经应用于评估肿瘤药物和生物治疗等的疗效，其包括先天免疫缺陷小鼠肿瘤移植瘤模型和基因工程小鼠模型等，这些模型受费用、肿瘤生长时间以及有效药物筛选方式等的明显限制，并且小鼠的生理学特性和对治疗的敏感性等也潜在地混淆了对药物筛选、效果和毒性的判断[5]。个体化肿瘤的基因改变均具备特异性，靶向药物的目的就是基于个性化治疗的基础上确定治疗目标的最大效应，而大部分抗肿瘤化学药物仅选择性地对一部分病人有益。如果体外试验能有力地证明某种药物对某一部分特异性人群有益，且能在全部人群中有明显的统计学意义，该药物就能够被批准应用，对于个体病人来说，会避免无效药物的过度性治疗以及有效药物的缺乏。随着前列腺癌微器官培养技术的发展和优化，从活检标本收集足够的材料，到新一代测序技术的普及和提高以及高效的临床和体外治疗试验的进行，这些新技术将是肿瘤诊治的重大的科学进步。

然而，目前还不清楚体外微器官培养对治疗的应答与其在体内应答的差异，正在进行新建立的癌细胞系对治疗的应答情况的回顾性研究。在微器官培养应用于临床药物试验之前，还需要大量仔细的前瞻性验证研究。

四、研究前景及展望

与常规二维细胞培养相比，应用前列腺癌微器官培养技术培养的癌细胞，其形态、组织结构、基因DNA状态、表达谱及基因信号传导途径特性等更符合人体肿瘤的实际生物学特性。很多肿瘤治疗的药物常常由于无法在动物模型或体外研究中获得准确的药物效应和毒性反应数据，而在临床试验阶段即被终止，浪费了大量的人力和物力资源。利用先进的微器官培养体系进行临床前期药物的疗效和安全性的评价和筛选，可大大降低药物研发的风险。人前列腺癌微器官培养技术可应用于前列腺癌的发病机制、发生发展过程和分子机制以及癌细胞的生长、侵袭、转移、与肿瘤微环境的相互作用等肿瘤生物学行为的研究；通过结合新一代基因分析等生物信息学技术，可筛选合适的靶向药物或特异性药物，结合其对化疗和放疗等综合治疗方式的敏感性，以达到实现肿瘤个体化精确治疗的目的。

微器官培养是一种新近发展的应用型技术，其用于前列腺癌的临床和基础研究还存在不成熟之处。相对于体内包括免疫系统在内的实际繁杂多变的内环境，体外微器官培养还只能模拟静态和短暂的体内微环境，尚不能完全取代二维细胞培养和动物模型。但微器官培养技术作为一种新的研究工具，具有二维细胞培养和动物模型的优点和自身的独特优势，有望成为肿瘤体外研究的新标准，在肿瘤临床和基础研究领域中有广阔的应用前景，综合应用可望最终达到改善前列腺癌患者预后、降低病死率和延长终末生存期的目的。

致谢：本研究课题受国家自然科学基金（NSFC #81372772）、江苏特聘教授科研基金[苏教师（2012）34 号]和江苏高校优势学科建设工程资助项目等资助

关键词器官培养技术; 前列腺肿瘤

参 考 文 献

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（2015-01-08收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.02.001

中图分类号R 737.25