流式细胞术在银屑病研究中的应用进展

刘汉清靳洪涛，2王爱平，2∗

流式细胞术在银屑病研究中的应用进展

刘汉清1靳洪涛1，2王爱平1，2∗

流式细胞术是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。本文就流式细胞术在银屑病研究中的最新进展进行综述。

银屑病； 流式细胞术； 淋巴细胞

银屑病是一种以表皮过度增殖伴角化不全及真皮淋巴细胞浸润为特征的皮肤病，发病机制复杂，病程长，易复发，难治愈，严重影响患者的生活质量。流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种新型、综合性细胞分析技术，在银屑病的研究中应用较为广泛，现对其进行综述。

1　淋巴细胞分类和亚群测定

免疫异常是银屑病主要发病机制之一。淋巴细胞是免疫系统的重要组成部分，FCM进行T细胞亚群测定在银屑病发病机制研究中应用广泛。如缪界萍1采用FCM测定发现银屑病患者外周血CD4+细胞百分率及CD4+/CD8+比值均低于正常人；尚智伟等2采用FCM检测发现银屑病患者外周血CD8+T细胞数量高于正常人；董萍云等3采用FCM检测发现银屑病患者外周血CD4+CD25+细胞占T细胞比例明显低于正常人；何荣国等4采用FCM检测发现银屑病外周血Th17细胞和Th17/Treg比例较正常人高，Treg细胞较正常人低。

采用FCM进行淋巴细胞亚群测定在银屑病的临床诊断中亦具有重要作用。银屑病按其临床表现可分为寻常型、脓疱型、红皮病型、关节病型。韩凌等5采用FCM检测发现红皮病型银屑病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞水平明显高于其他类型银屑病患者和正常人。Benham等6采用FCM检测发现Th17、Th22细胞在寻常型和关节病型银屑病患者和正常人外周血、滑液、滑膜中的细胞分布和频率存在差异。红皮病型银屑病和 Sézary综合征（Sézary Syndrome，SS）表现相似，易误诊，Nagler等7评估了应用FCM检测外周血特殊生物标记物在二者鉴别中的应用和不足，认为 CD4+/CD8+比率，CD7、CD26和CD27表达异常等可作为二者鉴别诊断的参考。邓田睿等8采用FCM检测银屑病患者临床痊愈时外周血T细胞亚群的情况，发现患者CD4+T细胞较低者近期复发的可能性更大，提示FCM检测T细胞亚群在监测银屑病的治疗效果方面亦有一定作用。

FCM检测淋巴细胞亚群在银屑病治疗药物和方法研究中应用广泛。杨晓梅等9采用FCM检测发现他克莫司治疗寻常型银屑病的机制可能是调节患者CD4+CD25+Treg细胞水平；贺红霞等10采用FCM观察发现寻常型银屑病患者外周血CD4+及CD4+/CD8+比值均低于正常人，CD8+高于正常参考值，而紫外线治疗可改善银屑病症状并使患者外周血T细胞亚群逐渐恢复正常。

由于百分比只能代表每种细胞在混合细胞群体中所占的比例，并不能体现其在单位体积液体中的绝对数量，因而具有一定的局限性。随着FCM的发展，目前已经实现淋巴细胞亚群的绝对计数。T细胞亚群绝对计数在国外实验室早已成为常规检查，但在国内仅有少数实验室开展。可以预见，流式细胞绝对计数在银屑病的研究中将具有广泛的应用前景。

2　细胞鉴定及活化状态研究

骨髓基质细胞（bone Inarrow stromal cells，BMSC）是存在于骨髓中的一类成体干细胞，可直接影响造血干细胞的发育而参与银屑病的发病。BMSC表面CD29表达为阳性，而CD34、CD45表达阴性。11近年来，原代培养的BMSC常被用于其参与银屑病发病的机制研究，通常在分离培养后采用FCM检测CD29、CD34、CD45的表达对其鉴定。12许多研究表明，淋巴细胞异常活化可能参与银屑病的发病，通过FCM检测淋巴细胞活化标志可分析其活化状态。共刺激分子CD28、CD80、CD86是决定T细胞激活的关键因素。CD80表达于活化的T细胞上，沈斌等13采用FCM检测发现银屑病患者外周血T细胞表面CD80的表达高于正常人且进行期高于退行期。韩义香等14通过FCM检测发现银屑病患者CD28在CD4+细胞和CD8+细胞上的表达均较正常人增加，CD80和CD86在CD4+细胞上的表达较正常人增加。CD69是T细胞早期活化标志分子。

3　细胞表面受体检测

趋化因子通过趋化因子受体对淋巴细胞、中性粒细胞、单核巨噬细胞等发挥趋化作用，从而在银屑病的发病、转归中发挥作用，目前关于CC趋化因子受体（chemokine C-C motif receptor，CCR）的研究较多。如刘海琴15采用FCM检测发现寻常型银屑病患者外周血T细胞CCR6表达率远高于正常人；樊昕等16发现寻常型银屑病患者皮损和外周血T细胞表面CCR7明显高于正常人。

红细胞是免疫系统的重要组成部分，研究表明银屑病患者红细胞I型补体受体（Complement Receptor，CR1）的表达高于正常人。CR1的特异性表面抗原为CD35，在进行FCM测定时，需用枸橼酸钠抗凝新鲜血样与CD35单克隆抗体混合，样本的处理方法与淋巴细胞测定时存在较大差别。17

Toll样受体（Toll-like Receptor，TLR）是天然免疫系统中的主要模式识别受体，CD14是脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）受体复合物中的成员。LPS与CD14、TLR4等受体复合物结合后可激活信号传导通路最终导致核因子（Nuclear Factor，NF）激活和炎症因子释放，参与银屑病的发病过程。徐丽敏等18采用FCM检测发现银屑病患者外周血CDl4和TLR4的表达均高于对照组。罗权等19FCM检测发现银屑病患者外周血CDl4+单核细胞TLR2、TLR4表达率均较正常人明显增高且进行期高于静止期，经甲氨蝶呤治疗后TLR2、TLR4的表达率明显低于治疗前，推测甲氨蝶呤能通过抑制TLR2、TLR4表达而发挥作用。

4　细胞因子和核因子定量分析

细胞因子是细胞被免疫原等刺激后所产生的一种低分子量、可溶性蛋白质，包括白介素（IL）、干扰素（IFN）、肿瘤坏死因子（TNF）等，具有调节免疫、血细胞生成、细胞生长以及损伤组织修复等功能。NF-кB是一种重要的核转录因子，介导NF-кB信号通路，TNF、IL-1等细胞因子可激活NF-kB，活化的NF-kB转位到核内与其相关的DNA基序结合以诱导靶基因的转录。许多研究表明细胞因子和NF-kB信号通路在银屑病的发病中具有重要作用。FCM可对多种细胞因子和 NF-кB进行定量分析。如陈洁等20采用FCM检测不同症候银屑病患者CD4+T细胞内细胞因子IFN-γ、IL-17A的表达情况，发现血热组银屑病患者外周血CD4+IFN-γ+水平显著高于血瘀组及正常人而各组间CD4+IL-17A+无显著性差异。高军等21将银屑病患者外周单个核细胞（PBMC）和角化细胞（KC）进行混合培养，采用FCM检测核转NF-κB的表达，ELISA法测上清液IL-8含量，发现银屑病患者NF-κB表达及IL-8含量较正常人显著上调，而雷公藤可下调NF-κB表达及IL-8含量。

除采用平均荧光强度或相对荧光强度进行的相对定量分析，随着定量流式细胞术（Quantitative Flow Cytometry，QFCM）的发展，还可对细胞因子等进行绝对定量分析。QFCM定量分析主要有两种：①定量抗体微球法：将包被不同IgG分子数的特制微球混合，然后与待测标本在相同条件下与荧光素标记的单克隆抗体反应并测定荧光强度，根据微球IgG分子数-荧光强度曲线和待测样本阳性细胞的荧光强度计算待测样本阳性细胞上的抗原分子数。②定量荧光素分子微球法：将包被不同荧光素分子数的微球混合后在相同的条件下测定此微球及待测细胞的荧光强度，根据微球荧光素分子数-荧光强度曲线和将待测样本阳性细胞荧光强度，可求得待测样本阳性细胞上的平均荧光素分子数，根据用于样本测定的单克隆抗体与荧光素结合的分子比例，可计算每个细胞上的平均抗原分子数。如赵京霞等22为研究IL-23/IL-17炎症轴在咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮肤损害中的作用采用定量抗体微球法检测了咪喹莫特诱导的银屑病小鼠血清细胞因子含量。

5　细胞周期和细胞凋亡测定

细胞周期和细胞凋亡测定是FCM最重要的应用之一，一般采用FITC标记的膜联蛋白（Annexin）-V和碘化丙啶（propidium iodide，PI）双染法测定。FCM检测细胞周期和细胞凋亡在银屑病研究中主要是用于治疗药物细胞水平的药效学和机制研究，所用细胞系主要为传代的角化细胞如人永生角质形成细胞株HaCaT和角质形成细胞株Colo-16。张晓杰等23采用FCM观察了清热利湿饮对HaCaT细胞周期的影响。段行武等24采用FCM检测了消银解毒饮及其拆方后的凉血、解毒和祛风除湿等三组主要成份含药血清对Colo-16凋亡的诱导作用。George等25运用FCM等技术研究了磷脂酰丝氨酸外在化等一系列细胞凋亡生物标记物，阐明了地蒽芬诱导角化细胞株HaCaT凋亡的剂量和时间依赖性。Li等26采用FCM等方法研究发现丹参酮IIA剂量和时间依赖性抑制鼠角质细胞扩散，诱导细胞凋亡，阐明了丹参酮IIA治疗银屑病的分子机制。

6　展望

FCM自20世纪70年代以来，被广泛应用于医药生物的多个领域。近年来，随着检测设备和技术的进步，FCM检测的广度和精确度有了长足发展。如流式微球分析技术使FCM从细胞检测发展到细胞外检测，从相对定量发展到绝对定量，检测标本也扩展到血清、血浆、培养液上清、体液可溶性物质体系，而且与传统方法比较具有灵敏度高、重复性好、样本用量少、检测效率高等特点；流式分子表型分析技术可检测细胞中特异性核酸序列或特异性基因异常；流式荧光原位杂交法可测定染色体端粒长度，能精度测定小于3Kb的端粒长度差；流式细胞分选技术可通过流动室喷口上的超高频电晶体使喷出的液流断裂为均匀的液滴，然后将带有不同的电荷的液滴流在高压电场的作用下偏转落入各自的收集容器中，从而实现细胞的分离。相信随着科技水平的进步，FCM将有进一步发展，并在银屑病的研究中发挥越来越重要的作用。

1缪界萍.寻常型银屑病患者的外周血T淋巴细胞亚群和血清肿瘤坏死因子α的变化及临床意义.中国医药指南，2010，1：12-13.

2尚智伟，李其林，李晓辉，等.173例寻常型银屑病患者外周血T淋巴细胞亚群、免疫球蛋白及补体水平与PASI相关性分析.岭南皮肤性病科杂志，2009，16（4）：228-231.

3董萍云，邓爱兵，褚京津，等.寻常型银屑病患者外周血CD4+CD25+Treg细胞水平的表达.中国现代医学杂志，2010，12：1806-1809.

4何荣国，伍绍国，田华，等.寻常型银屑病患者外周血Thl7/ Treg失衡的研究.中华皮肤科杂志，2011，44（6）：411-414.

5韩凌，黄琼，方栩，等.银屑病外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的表达.中国麻风皮肤病杂志，2009，25（10）：722-724.

6 Benham H，Norris P，Goodall J，et al.Th17 and Th22 cells in psoriatic arthritis and psoriasis.Arthritis Res Ther，2013，15（5）：R136.

7 Nagler AR，Samimi S，Schaffer A，etal.Peripheral blood findings in erythrodermic patients：importance for the differential diagnosis of Sézary syndrome.JAm Acad Dermatol，2012，66（3）：503-508.

8邓田睿，瞿幸.银屑病愈后复发与外周血T淋巴细胞关系研究.中医临床研究，2011，3（20）：43-44.

9杨晓梅，何荣国.外用他克莫司对寻常型银屑病患者CD4+CD25+调节性 T细胞的影响.国际医药卫生导报，2010，16（15）：1858-1861.

10贺红霞，白莉，郭书萍.窄谱中波紫外线对寻常型银屑病外周血T淋巴细胞亚群的影响.山西医药杂志，2010，39（11）：1005-1006.

11孟维维，田畔，张振颖，等.银屑病骨髓间质干细胞的生物学特性.中华皮肤科杂志，2010，2：108-110.

12刘瑞风，冯海燕，张静，等.银屑病患者骨髓基质细胞生物学活性研究.临床皮肤科杂志，2011，40（9）：540-542.

13沈斌，程浩，李凌，等.银屑病患者外周血T淋巴细胞CD80的表达.中国麻风皮肤病杂志，2005，21（7）：521-523.

14韩义香，杨毅，章圣辉，等.银屑病患者外周血T细胞亚群及B7/CD28的表达.中国麻风皮肤病杂志，2007，23（10）：908-909.

15刘海琴.窄谱中波紫外线对寻常型银屑病患者外周血T细胞CCR6表达的影响.中国皮肤性病学杂志，2011，25（11）：851-853.

16樊昕，王刚，刘玉峰.寻常型银屑病患者趋化因子受体7表达及其意义探讨.中国皮肤性病学杂志，2006，20（12）：724-726.

17许文，顾军，郭峰，等.系统性红斑狼疮和银屑病患者外周血细胞黏附功能与红细胞表面及血小板CD35的活性研究.中国麻风皮肤病杂志，2007，23（6）：485-488.

18徐丽敏，韩静倩，赵宏丽，等.银屑病患者外周血白细胞mCD14、TLR4和核因子-κB的表达.中华皮肤科杂志，2008，41（10）：689-691.

19罗权，林玲，李嘉彦，等.甲氨蝶呤对寻常型银屑病患者外周血CDl4+单核细胞Toll样受体2，4表达的影响.中华皮肤科杂志，2009，42（11）：760-762.

20陈洁，徐蓉，李欣，等.不同证候银屑病患者外周血Thl/Thl7细胞表达差异的研究.中华皮肤科杂志，2013，46（3）：172-175.

21高军，任万明，张志鹏.雷公藤多甙对银屑病患者NF-кB及细胞因子的影响.西部中医院，2013，26（9）：26-28.

22赵京霞，底婷婷，王燕，等.IL-23/IL-17炎症轴在咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮肤损害中的作用.中国病理生理杂志，2013，29（6）：1086-1094.

23张晓杰，孙淑娜，鲁娟娟，等.清热利湿饮对HaCaT细胞增殖的影响.中国麻风皮肤病杂志，2013，29（1）：3-5.

24段行武，赵立军，张霞，等.消银解毒饮及拆方对角质形成细胞COLO-16凋亡的调控作用.中国麻风皮肤病杂志，2010，26（4）：256-258.

25George SE，Anderson RJ，Haswell M，et al.An investigation of the effects of dithranol-induced apoptosis in a human keratinocyte cell line.JPharm Pharmacol，2013，65（4）：552-560.

26 Li FL，Xu R，Zeng QC，et al.Tanshinone IIA inhibits growth of keratinocytes through cell cycle arrest and apoptosis：Underlying treatmentmechanism of psoriasis.Evid Based Complement AlternatMed，2012，2012：927658.

（收稿：2014-05-06 修回：2014-07-16）

Update of flow cytometry app lication in psoriasis research

LIU Han-qing，JIN Hong-tao，WANG Ai-ping.Institute ofMateria Medica，Chinese Academy ofMedical Sciences&Peking Union Medical College，100050

Flow cytometry（FCM）is a detection method which can quantitatively analyze separate single cells or other biological particles at the functional level.FCM can analyze thousands of cells rapidly and get multiple parameters from one cell.The progress of FCM application in psoriasis research is reviewed in this article.

psoriasis；flow cytometry；lymphocyte

国家重大新药创制资助项目（编号：2013ZX09302302，

2012ZX09J12203，2012ZX09301002-001-009）

1中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，北京，100050

2北京协和建昊医药技术开发有限责任公司，100176