自体骨髓干细胞移植治疗重度下肢缺血性疾病的疗效分析

吕晓霞张精勇陈帼玲高培显王茂华吴学君金星

自体骨髓干细胞移植治疗重度下肢缺血性疾病的疗效分析

吕晓霞1张精勇1陈帼玲2高培显1王茂华1吴学君1金星1

目的 观察自体骨髓干细胞移植治疗慢性下肢缺血的临床疗效。方法 观察山东大学附属省立医院血管外科自2004年9月至2012年9月接受自体干细胞移植的下肢重度缺血患者79例，评定患者自体骨髓干细胞移植前、移植后1个月及6个月时患肢疼痛评分、踝肱指数、间跛距离的改变情况来评价临床疗效。结果 治疗后1个月及6个月，患肢疼痛评分由术前的7.51 ± 1.18缓解至术后4.03 ± 1.12，3.38 ± 1.32，与术前比较差异均有统计学意义（P ＜ 0.05）。移植后1个月与移植后6个月评分比较，差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。间跛距离由术前的（65 ± 15）m，增加至术后的（165 ± 105）m，（195 ± 95）m，与术前比较差异均有统计学意义（P ＜ 0.05）。移植后1个月与移植后6个月评分比较，差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。踝肱指数由术前的0.22 ± 0.10，提高至术后的0.31 ± 0.05，0.34 ± 0.09，与术前比较差异均有统计学意义（均P＜ 0.05）。移植后1个月与移植后6个月评分比较，差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。结论 自体骨髓干细胞移植对缓解肢体疼痛，提高间跛距离，加快溃疡面愈合疗效确切。

骨髓； 干细胞移植； 自体； 下肢； 缺血； 动脉闭塞

下肢动脉缺血性疾病严重影响患者生活质量，威胁老年人的生命健康。随着我国逐渐进入老龄社会，以及人们饮食生活习惯的改变，下肢动脉缺血性疾病的发病率越来越高。周围动脉闭塞性疾病患病率为每年500 ～ 1 000/百万［1-2］，其中4.3%～ 9.6%最终发展为严重肢体缺血，最后导致截肢［3］。药物治疗、介入治疗和动脉搭桥手术是下肢动脉慢性缺血性疾病的主要治疗方法。许多存在静息痛的重度下肢动脉缺血患者，已经丧失动脉搭桥和介入治疗条件，药物治疗效果不理想，仍没有满意的治疗方法。我院血管外科依据骨髓干细胞具有高度增殖并分化为体内各种细胞的潜能，移植后能够提供各种成血管细胞因子，促进血管生成的原理，应用自体骨髓干细胞移植技术治疗79例慢性下肢缺血疾病患者，取得满意疗效，总结报道如下。

资料与方法

一、一般资料

下肢动脉慢性缺血性病变无动脉搭桥术或介入治疗适应证并愿意接受干细胞移植的患者79例，男51例，女28例，年龄在33 ～ 83岁之间，平均年龄67岁。其中下肢动脉硬化闭塞症49例，血栓闭塞性脉管炎9例，糖尿病足21例。其中12例曾行介入治疗，2例曾行动脉搭桥治疗。全部患者均有足部和（或）下肢发凉、麻木、间歇性跛行、静息痛，11例患者存在足趾溃疡，8例患者存在足趾坏疽。辅助检查：79例患者均经下肢血管彩色多普勒、CT血管成像和（或）动脉造影检查，股浅动脉、股深动脉存在长段狭窄或者闭塞72例，腘动脉狭窄或者闭塞66例，79例均存在胫前动脉、胫后动脉和腓动脉广泛狭窄或者闭塞。

二、方法

（一）纳入标准

（1）行数字减影血管造影、CT血管造影显示患肢膝下动脉广泛狭窄或闭塞；（2）无法行搭桥手术及介入治疗；（3）经药物治疗，患肢静息痛不能明显缓解；（4）所有患者均经医院伦理委员会讨论通过，签署知情同意书。排除标准：存在血液系统疾病、恶性肿瘤、严重心肺脑等脏器功能不全等。

（二）病情评估

全部患者分别于移植前、移植后1个月，6个月，通过患肢疼痛评分、踝肱指数、间跛距离对患肢缺血程度进行评价；疼痛评分：按患肢静息痛程度分别记为0 ～ 10分，0分为无痛，10分为最剧烈疼痛。踝肱指数测定：移植前、移植后1个月、6个月测量患肢踝肱指数；间跛距离测定：移植前、移植后1个月、6个月测量患肢踝肱指数。

（三）移植方法

1.术前骨髓评估：移植前进行骨髓像评估，术前先抽取0.1 ml做骨髓涂片以排除血液病，本组发现3例骨髓增殖减低，应用粒、单核细胞集落刺激因子，4 d后复查明显好转。单个核细胞的获得：患者取俯卧位，床旁心电监护。取双侧髂后上棘为骨髓穿刺点，常规消毒，铺洞巾，1%的利多卡因行穿刺部位局部麻醉。穿刺的合适深度为骨穿针被髂骨固定，抽取骨髓时，先抽取1 ml肝素盐水再抽取9 ml的骨髓血。使用多侧孔骨髓穿刺针，多点多方向抽取，可以抽取更多的骨髓血。抽取自体骨髓血300 ～ 400 ml，贴壁注入无菌骨髓血保养袋中，混匀。在体外经过人间充质干细胞分离液处理，离心后提取单个核细胞层，分离的单个核细胞计数为（0.038 ～ 8.6）× 108个。

2.干细胞鉴定：对分离的骨髓干细胞进行鉴定，对所获得的细胞进行表面标志，流式细胞仪分析具有：HMSC独特的表型特征，即CD29、CD44阳性和CD34、CD45阴性。表达的细胞比率分别为CD29（94.3%），CD44（94.3%）和CD34（1.7%），CD45（0.9%）。

3.干细胞移植：硬膜外麻醉，根据CT血管造影，在动脉闭塞近端约5 cm处开始注射，一直注射至足部。注射点用记号笔标记。注射点沿主要血管走行区域纵向线型排列，一般患肢内、外侧，足背、足底各3列，上下每两点之间间隔约1 cm，两排之间间隔1.5 ～ 2 cm，注射量为0.5 ml/穿刺点，患者所需注射液总体积为注射针数× 0.5 ml，以生理盐水将提取的干细胞稀释至所需注射液量。注射深度要注射入患肢肌肉层内，依胖瘦不同约为皮下1 ～ 2 cm，注射后以无菌纱布，弹力绷带加压包扎。术后1 ～ 2 d出院。

4.随访情况：患者出院前，术后1个月、6个月、12个月门诊随访，记录患者的疼痛评分，踝肱指数，间跛距离，并观察患肢皮肤溃疡愈合情况。

三、统计学分析方法

采用SPSS 13.0统计软件进行分析，疼痛评分、间跛距离和踝肱指数均以±s表示，移植前后观察指标的对比，使用自身配对资料的t检验，以P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

结　果

1.随访结果：所有患者均接受临床随诊，无脱漏，随访6 ～ 18个月，平均12个月，移植过程中以及移植后均无严重并发症发生，所有患者随访期间无死亡。

2.临床效果：患者观察指标评分：治疗后1个月及6个月，患肢疼痛评分由术前的7.51 ± 1.18缓解至术后4.03 ± 1.12，3.38 ± 1.32，与术前比较差异有显著性意义（P ＜ 0.05）。移植后 1个月与移植后6个月评分比较，差异无显著性意义（P ＞ 0.05）。间跛距离由术前的（65 ± 15）m，增加至术后的（165 ± 105）m，（195 ± 95）m，与术前比较差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。移植后1个月与移植后6个月评分比较，差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。踝肱指数由术前的0.22 ± 0.10，提高至术后的0.31 ± 0.05，0.34 ± 0.09，与术前比较差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。移植后1个月与移植后6个月评分比较，差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。

术后第1天患者均反映患肢不适感好转，静息痛减轻。术后1个月57例（72.2%）患者静息痛消失或明显减轻，冷感减轻。11例伴有溃疡的患者，移植后1个月溃疡完全愈合3例，溃疡创面明显缩小5例，无明显变化3例，有效率72.7%；移植1年后肢体溃疡愈合7例，溃疡创面明显缩小2例，无明显变化2例，有效率为81.8%。8例足趾坏疽患者中，3例症状明显缓解，静息痛消失，行坏疽足趾切除，愈合良好；4例疼痛消失，坏疽边界清楚，等待坏疽组织自行有脱落；1例于膝下截肢。

本组病例中有11例于术后3 ～ 6个月症状出现反复。3例表现为晚间患肢麻木、怕冷，但无明显疼痛；4例表现为跛行距离恢复至术前水平，继续应用药物治疗；4例再次出现静息痛，其中3例再次给予自体干细胞移植，静息痛消失；1例行膝下截肢手术，术中发现残端血运丰富，术后创面愈合良好。

讨　论

2002年，国际上首次报道了骨髓单个核细胞移植治疗下肢动脉缺血性疾病的临床应用［4］。2004年，Gu等［5］首次报道了在国内将骨髓间充质细胞应用于下肢缺血性疾病中取得良好效果，随后国内多家医院将此项治疗技术应用于临床工作并进行报道［6-7］。

随着干细胞研究的深入及其分离技术的发展，用干细胞移植治疗下肢缺血性疾病使很多患者受益。目前研究表明，成体干细胞具有多分化潜能，可分化为血管内皮细胞，进一步分化形成新生毛细血管。自体干细胞移植正是利用这一原理，将干细胞移植到缺血的肢体肌肉中，使其分化、形成新生毛细血管，改善和恢复下肢血流，达到治疗下肢缺血的目的。

骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病的机制可能与以下因素有关［8］：（1）分泌促血管生成因子促进缺血坏死区域血管网络重建；（2）体外细胞培养时多种骨髓源性干细胞可被诱导分化为内皮细胞或平滑肌细胞，干细胞可能作为细胞材料参与血管壁的组成；（3）通过旁分泌途径促进侧支循环的建立，并能扩大动脉内径改善有效的血液灌注；（4）抑制组织凋亡。实验也证实了干细胞移植通过抑制下肢缺血坏死组织的细胞凋亡、促进血管形成、减小溃疡面积等机制参与改善下肢血运功能。

另一个值得注意的现象是，虽然所有研究均报道取得良好效果，但是不同的研究所移植的单个核细胞数量却明显不同。在骨髓单个核细胞移植的报道中，抽取的骨髓量介于80 ～ 1 000 ml，获取的单个核细胞从0.1 × 109至34 × 109数量相差悬殊［4，9-10］。本组病历每例患者抽取自体骨髓血300 ～ 400 ml，分离的单个核细胞计数为（0.038 ～ 8.600）× 108个，患者均取得较好的治疗效果，表明干细胞移植在一定干细胞数量级范围内均可以达到治疗效果，移植的干细胞数量与肢体缺血的治疗效果之间的关系还需要更加深入地进行研究。

本组资料发现，自体干细胞移植能够明显缓解患者下肢缺血症状，尤其能够缓解患者静息痛。术后第1天患者均反映患肢不适感好转，静息痛减轻。术后1个月72.2%的患者静息痛消失或明显减轻，冷感减轻。疼痛评分术前与术后1个月，6个月比较差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。静息痛是下肢缺血患者的巨大痛苦，严重影响患者的生活质量，影响患者睡眠、饮食，进而诱发心脑血管疾病，威胁患者生命。干细胞移植通过缓解患者静息痛，能够明显提高患者的生活质量，延长患者的寿命。但在对比自体干细胞移植术后6个月与1个月的观察指标发现，虽然疼痛评分，踝肱指数以及间跛距离均有改善，但两者之间比较均没有显著性差异，说明自体干细胞移植1个月后，患肢血运改善处于比较稳定的状态，随时间延长，自体干细胞并没有进一步明显改善患肢的缺血状况。本组病例数量较少，随访时间不足，还应当进一步增加病例数量及随访时间，明确自体干细胞移植改善患肢血运效果与时间的关系。

本组病例中有11例于术后3 ～ 6个月症状出现反复，其中3例出现静息痛的患者再次给予自体干细胞移植，静息痛消失。笔者认为自体干细胞移植创伤小，对部分1次移植后效果不满意或症状出现反复的患者，可以再次进行自体干细胞移植，多能明显改善患者症状。

下肢动脉缺血患者多为老年人，本组患者平均年龄67岁，多合并心脑血管疾病，在抽取患者骨髓血时，需要对患者进行心电监护，同时静脉补充液体，防止抽取骨髓血过程中，患者血容量短时间内减少，造成患者不适，诱发心脑血管意外。一般抽取骨髓血300 ～ 400 ml，提取干细胞后利用生理盐水将干细胞稀释至所需液体量。注射干细胞时，每注射点注射干细胞液0.5 ml，注射深度应为1 cm左右，在肢体消瘦的患者注射时，可以斜行注射，注射针头稍停顿后再退出，注射后应用纱布稍作按压，防止干细胞液反流出体外，造成干细胞液浪费。干细胞移植完成后，应利用弹力绷带适当加压包扎，更好的利于干细胞吸收。

基础和临床研究均表明，干细胞移植治疗动脉缺血性疾病疗效是肯定的［5，11-12］，综合本临床观察结果提示，自体骨髓干细胞移植能够明显缓解肢体疼痛，同时增加踝肱指数，提高间跛距离，且未发现明显副作用。相信随着自体骨髓干细胞移植研究的深入，将为丧失手术和介入治疗机会的重症下肢动脉缺血性疾病治疗开辟新的天地。

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Efficacy of autologous bone marrow stem cell transplantation in treatment of lower limbischemia

Lyu Xiaoxia1， Zhang Jingyong1， Chen Guoling2， Gao Peixian1， Wang Maohua1，Wu Xuejun1， Jin Xing1.1Department of Vascular Surgery， Provincial Hospital affiliated to Shandong University， Jinan 250021，China；2Medstar Georgetown University Hospital， Washington DC 20007， USA

Zhang Jingyong， Email： zhangjingyongys@163.com

Objective To evaluate the efficacy of autologous transplantation of bone marrow stem cell （BMSC） for treating chronic ischemia of the lower limbs. Methods Totally 79 patients with chronic ischemia of the lower limb were enrolled from September 2004 to September 2012. All the patients were not suitable for surgery treatment or interventional treatment and were willing to receive autologous BMSC transplantation.The clinical outcomes of patients were assessed by pain symptom， walking ability， ankle-brachial index of the lower limbs before and 1 and 6 months after BMSC treatment. Results The pain score decreased at 1 and 6 months after transplantation compared with that before transplantation， and the difference was significant （P ＜ 0.05）.There was no significant difference in pain score between 1 month after transplantation and 6 months after transplantation （P ＞ 0.05）. Ankle-brachial index was significantly increased at 1 and 6 months when compared with that before transplantation，and the difference was significant （P ＜ 0.05）. There was no significant difference between 1 month and 6 months after transplantation （P ＞ 0.05）. The walking distances was significantly increased at 1 month and 6 months， and there was significant difference of walking distancewhen compared with that before transplantation （P ＜ 0.05）. There was no significant difference between 1 months and 6 months after transplantation （P ＞ 0.05）. Conclusion Autologous BMSC transplantation was effective in terms of pain and walking distance， and can promote wound healing in patients with chronic ischemia of the lower limbs.

Bone marrow； Stem cell transplantation； autologous； lower limb；ischemia； artery occlusion

2015-03-09）

（本文编辑：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2015.04.003

250021 济南，山东大学附属省立医院血管外科1；20007，美国华盛顿哥伦比亚特区乔治城大学医院移植外科2

张精勇，Email： zhangjingyongys@163.com