多能干细胞向角膜上皮分化的研究进展

王振宇周庆军史伟云

多能干细胞向角膜上皮分化的研究进展

王振宇1，2周庆军2史伟云2

许多患者因眼表疾病而遭受视力损害，角膜或角膜缘干细胞移植是这类患者重建光明的希望，但由于供体材料短缺，限制了其临床应用，使很多患者无法得到有效的治疗。随着多能干细胞分化研究的深入，已有多种方法将多能干细胞诱导分化为角膜上皮样细胞，利用多能干细胞产生角膜上皮组织供临床移植成为解决这一问题的思路之一。本文总结近年来诱导多能干细胞分化为角膜上皮样细胞的研究进展，并在此基础上对分化细胞的纯化鉴定、安全性和临床应用所面临的问题等进行讨论。

多能干细胞； 上皮，角膜； 细胞分化； 角膜缘

根据世界卫生组织数据，全球约有上千万人因各类角膜疾病遭受视力损害甚至失明，造成个人、家庭严重的身心损害及社会沉重的经济负担，成为继白内障后第二大类致盲性眼病，尤其是在发展中国家和经济欠发达地区［1］。其中，很多患者的视力损害是由于角膜缘干细胞缺陷（limbal stem cells defi ciency， LSCD）所造成。角膜缘干细胞（limbal stem cell， LSC）是一群位于角膜缘深部的干细胞，能够自我更新和分化为角膜上皮细胞，对于维持角膜上皮完整、阻止结膜侵入至关重要。化学伤、热烧伤及Stevens-Johnson综合征等原因造成的眼表损伤常引起LSC的衰竭，造成LSCD，导致一系列不良反应：角膜上皮反复缺损、糜烂、溃疡、角膜结膜化、新生血管长入及假性胬肉形成，最终造成视力损害［2］。

对于LSCD造成的眼表损害，目前常见的治疗有自体（异体）角膜缘移植、体外培养的LSC移植、体外培养的口腔黏膜细胞移植、自体（异体）结膜移植、羊膜移植等。虽然临床上取得了一定的疗效，但仍然存在材料来源有限、易对供体造成损害、异体排异反应、对于重症患者疗效有限等问题［3-4］。而以多能干细胞为基础的细胞替代疗法可以缓解上述问题，为临床提供新的思路和治疗方式。

多能干细胞包括胚胎干细胞（embryonic stem cell， ESC）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell， iPSC），均具有无限自我更新和分化为三个胚层、各种细胞类型的能力。ESC来自囊胚内表面的细胞群，安全稳定，可以为临床提供各种所需细胞类型。iPSC是将体细胞通过重编程而获得的多能干细胞［5-6］，将患者体细胞重编程后可获得个体特异的干细胞，避免了免疫排异反应和伦理道德障碍。近年来多个研究通过不同方法从多能干细胞中诱导分化得到具有一定干细胞功能的角膜上皮样细胞，使其临床应用成为可能。

本文总结近年来iPSC分化为角质细胞（keratinocyte）、角膜上皮样细胞（corneal epitheliumlike cell）的方法和进展，探讨分化细胞的纯化和鉴定、致瘤性和排斥性、生理功能等问题，并分析临床应用的前景和可能遇到的问题，为科研和临床中更好地治疗此类疾病提供思路。

一、多能干细胞向角质细胞分化

人们最早关注多能干细胞向上皮分化的是皮肤角质细胞，希望通过干细胞重建皮肤上皮，为皮肤移植提供材料。角膜上皮与皮肤上皮同属于上皮组织，发育上都是从外胚层发育而来，二者在结构、生理特性上有许多相似之处，对诱导分化角质细胞的理解有助于更好地研究角膜上皮样细胞的分化。

1. ESC向角质细胞分化：最初，在小鼠ESC的研究中发现，骨形态发生蛋白4（bone morphogenetic protein 4， BMP-4）可诱导上皮分化，BMP信号在胚胎发育早期外胚层的命运选择上具有重要作用［7］，而维甲酸（retinoic acid， RA）是细胞增生和分化的调节剂，可抑制细胞终末分化［8］。据此，Metallo等报道了一种利用BMP-4和RA等小分子诱导人ESC上皮分化的方法：利用含RA和BMP-4的培养基培养6 d以诱导分化，再在普通无血清培养基中继续培养，结果显示角质细胞标记物CK14阳性的细胞比例持续增加，在大约第30天可达到35%［9-10］。Guenou等［11］则利用BMP-4和抗坏血酸（ascorbic acid， AA）诱导人ESC分化，并将分化细胞种植于纤维蛋白基质上，移植到免疫缺陷小鼠体内。结果显示分化细胞表现为基底角质细胞的表型，在移植到小鼠体内12周后，可形成与成熟人体皮肤一致的结构。该作者之所以利用AA而不是RA诱导是因为他认为AA能够刺激完全的角质细胞分化，并且他在细胞培养的全程（约40 d）持续应用AA，更接近胚胎发育时的上皮形成过程。

2. iPSC向角质细胞分化：iPSC的成功突破为组织再生提供了一种新的多能干细胞，它具有与ESC同样的多能性。研究发现iPSC能够分化为多种细胞类型，包括树突状细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、运动神经元和胰岛素生成细胞等［12］。2011年，两个研究团队都利用RA和BMP-4诱导的方法，使iPSC产生具有一定干细胞特性的角质细胞［13-14］。区别为一个是依次RA处理3 d、BMP-4处理3 d诱导分化后再培养，而另一个是RA和BMP-4处理2 d后转入含BMP-4的培养基中培养。进一步将BMP-4诱导产生的表皮祖细胞种植于明胶中，再移植到裸鼠角膜上，可形成复层的表皮结构［15］。以大疱性表皮松解症患者的皮肤成纤维细胞获得的iPSC，经RA和BMP-4诱导的方法也可产生角质细胞，将角质细胞种植在胶原和成纤维细胞混合的基质上，可形成三维的与皮肤类似的组织，为患者特异性的治疗打下基础［16］。

二、多能干细胞向角膜上皮样细胞分化

角膜结构简单，具有独特的免疫赦免机制，是细胞及器官移植的理想场所，利用多能干细胞获得可供移植的眼表组织是研究者一直所期望的。研究者根据表皮角质细胞分化的经验，进一步研究多能干细胞向角膜上皮样细胞的分化策略。

1. ESC向角膜上皮样细胞分化：研究发现，许多组织中干细胞龛（Niche）在维持干细胞的特性方面具有重要作用，对于LSC也是如此。LSC与龛的相互作用包括与周围角膜缘成纤维细胞的作用，与基底膜中胶原IV的作用，与周围分泌的细胞因子的作用等［17-18］。因此，研究者设想是否可以体外模拟LSC龛的微环境，诱导ESC向角膜上皮样细胞分化。利用胶原IV模拟细胞外基质，利用角膜缘成纤维细胞或LSC条件化的培养基模拟LSC龛的微环境，实现了人ESC向角膜上皮样细胞的分化［19］。但此方法在诱导小鼠ESC时效果不理想，推测可能与ESC的种属差异有关，前述研究以人ESC为对象而该研究以小鼠ESC为对象［20］。利用条件培养基诱导分化得到的角膜上皮样细胞种植在脱细胞的猪角膜基质上后，可形成具有生物功能的组织工程角膜，能够成功重建损伤的眼表［21］。

根据RA和BMP-4等小分子化合物诱导ESC向皮肤角质细胞分化的经验，研究者尝试通过调整小分子化合物的浓度、作用时间、作用顺序等条件，实现了ESC向角膜上皮样细胞的诱导分化。普遍的方法是先利用RA预处理ESC 1 ～ 3 d，再利用小分子化合物组合诱导分化，最后在角膜上皮培养基中自发分化2周到2个月不等的时间得到角膜上皮样细胞或形成复层［22-23］。

Pax6是在眼部发育中一个重要的转录因子，特别是在角膜、晶体、神经视网膜等结构的形成和功能上具有重要作用［24］，利用Pax6的功能诱导ESC向角膜上皮分化也是一个方向。将带有绿色荧光蛋白的Pax6 cDNA通过电转染的方法转移到小鼠ESC中，2周后转染成功的细胞有一半分化为角膜上皮样细胞［25］。相反，Pax6基因敲除后，正常的LSC则倾向于向皮肤的角质细胞分化，角膜上皮的修复能力也下降了，从另一方面证明了Pax6的作用［26-27］。最近发现ABCB5与Pax6类似，也是角膜上皮发育和修复中非常重要的基因，或许能在ESC向角膜上皮的分化中起作用［28］。但基因转染有一定的安全风险，目前还不适宜临床应用，因而此方法研究得较少。

2. iPSC向角膜上皮样细胞分化：与角质细胞分化研究一样，iPSC成功突破后，研究者也开始关注诱导iPSC向角膜上皮样细胞分化。依然根据角膜缘微环境能够调控干细胞生理特性的原理，将小鼠iPSC培养于胶原IV包被的培养板中，通过Transwell共培养系统与分离的角膜缘成纤维细胞共培养，实现了iPSC向角膜上皮样细胞的分化［29］。如果iPSC经过BMP-4提前预处理，分化效果可能更好［30］。研究发现，iPSC有向其来源组织分化的倾向，例如，通过角膜缘上皮细胞获得的iPSC比通过皮肤成纤维细胞获得的iPSC更易分化为角膜上皮样细胞，分析显示二者在甲基化区域上略有差别，可能与二者分化倾向不同有关［31］。而结膜上皮细胞因为内源性表达SOX2和OCT4因子，比结膜基质细胞更容易转分化为iPSC，并且这种细胞类型在视网膜色素上皮的分化中更有优势，为iPSC在眼科的应用提供新选择［32］。

三、分化细胞的纯化和鉴定

虽然上述方法可以得到角膜上皮样细胞，但最终分化细胞中还夹杂着未分化的细胞、分化为其他类型的细胞等，目前各种诱导方法的分化效率并不很高，这些杂细胞不仅影响临床应用的疗效，也增加了致瘤性、排斥反应等风险。因此，如何增加细胞的分化效率、从分化的细胞中纯化角膜上皮样细胞还需要深入研究。例如，研究发现在RA诱导分化过程中能促进β-catenin至细胞膜的转运并下调Wnt信号通路，因此通过人为抑制Wnt信号通路，能够促进iPSC向角质细胞的分化并提高分化效率［33］。由于终末分化的角膜上皮细胞中高表达阶段特异性胚胎表面抗原4（SSEA4），而LSC中SSEA4阴性的细胞较多，因此可利用磁床以SSEA4为阴性标记物实现对分化细胞的纯化［34］。也有研究者通过分化细胞中不同类型细胞对细胞外基质黏附性不同的特点来分选细胞，以获得纯度较高的角膜上皮样细胞。

同时，目前缺乏一种角膜上皮样细胞或LSC有效而特异的理想标记物，对于分化的角膜上皮样细胞的鉴定，只能依靠一系列细胞阳性、阴性标记物的组合［35］，因此寻找LSC的特异性标志物也是迫切需要解决的问题。Oct4、Nanog、SSEA1等为多能性干细胞的标记物，其在多能性干细胞中高表达而在分化的细胞中低表达，这些标记物阴性表达表明细胞已经分化较完全［36］。CK15和ABCG2表达于角膜缘基底部和球结膜，被认为是相对特异的LSC标记物［37］。转录因子p63对于干细胞的增殖能力起重要作用，在皮肤和角膜缘上皮的基底部均高表达，但其亚型ΔNp63α则对于LSC具有较好的特异性［38］。CK3/12为角膜上皮细胞的特异标记物，而CK14为皮肤角质细胞的特异标记物，用此可区分分化细胞是接近角膜上皮还是皮肤上皮［39-40］。

四、分化细胞的安全性

通过体外培养、分化而得到的细胞在应用于临床前，必须保证其安全性，这里主要指其致瘤性和排斥性，如何鉴定和保证分化细胞无致瘤性和低排斥性是其临床应用前的关键。ESC或iPSC因为自我更新和分化为各类细胞的特性，能够在体内自发形成含有多种组织成分的畸胎瘤甚至恶性程度极高的畸胎癌。目前，减少致瘤性的方法主要是应用多能干细胞来源的分化细胞，清除分化细胞中残存的多能干细胞，分化程度越高，多能干细胞来源细胞的致瘤性越低。但多能干细胞来源的角膜上皮样细胞必须具有一定的干细胞特性，使其移植后能够在体内持续增殖，而只要具有干细胞性，就很难完全消除其致瘤性［41］。目前的分化方法也不能保证分化细胞中完全不含有多能干细胞，研究发现即使单个多能干细胞植入体内也能够形成肿瘤［42］。WHO的TRS 878指南是关于细胞致瘤性研究的唯一一份国际指南［43］，但因为从多能干细胞中分化得到的细胞不在该指南的适用范围内，因此对于分化细胞确切的致瘤性仅能参考而无法确切评估。

ESC最初被认为具有免疫赦免特性，能够逃避免疫监视和攻击，因为研究发现ESC低表达MHCⅠ类、Ⅱ类分子和共刺激分子［44］，同时ESC具有一定的免疫调节功能［45-46］，如抑制T细胞的增殖，诱导免疫细胞的凋亡，募集Treg细胞等。虽然随着ESC分化程度增加其MHCⅠ类、Ⅱ类分子的表达增加，但仍低于正常成体细胞的水平。这并不意味着可以忽视多能干细胞分化细胞的排斥风险，因为在炎症环境的刺激下其MHCⅠ类分子的表达迅速增高［44］，次要组织相容性抗原也在分化细胞的排斥反应中发挥重要作用［47］。在分化培养过程中动物产品或非生理成分的应用以及长时间培养本身都可能增加细胞的抗原性［48］。因此，正确评价分化细胞的排斥性、制定适合的临床抗排斥治疗方案也是其应用于临床前必须做的工作。

五、分化细胞的生理功能

目前，虽然多种方法可以从ESC或iPSC中获得角膜上皮样细胞，但这些细胞仅仅是通过一些标志蛋白如CK3/12、Integrin、E-cadherin以及短期动物实验来检测其是否具有角膜上皮细胞的功能，未见分化细胞用于人体或灵长类动物的报道，因此分化细胞具有怎样的生理功能、能够满足临床移植的需要仍有待研究。原本认为体外培养的LSC或口腔黏膜细胞移植后发挥作用主要是替代角膜上皮，但研究发现缺乏供体细胞长期存在的证据，推测其一部分作用可能是促进眼表其他部位残存的上皮干细胞的活性，使受体原有角膜上皮得以恢复［49-50］。若从多能干细胞中分化的角膜上皮样细胞移植后有效，那么其发挥替代作用还是营养作用的就需要明确，这将直接影响临床手术方式和术后治疗管理的选择。研究发现，LSC不仅能产生角膜上皮发挥屏障功能，也能够分泌一些抗血管生成因子，具有抗炎和抑制角膜新生血管的作用，是生理情况下维持角膜无血管化的重要机制，也是治疗LSCD的关键作用之一［51］。体外培养的口腔黏膜细胞移植虽然也取得了一定的临床疗效，但其抗新生血管的作用就明显弱于体外培养的LSC［52］，由多能干细胞分化的角膜上皮样细胞的抗新生血管作用如何，目前并未得到系统的研究，这也是关系到其临床疗效的主要问题。

六、临床应用中需要解决的问题

干细胞基础研究方面取得的成果为其临床应用奠定了坚实的基础，但在实际应用过程中，还有许多临床问题有待解决。首先是要确定什么样的细胞可用于临床治疗，无论从ESC还是iPSC分化得到的细胞，要满足一定的标准才能保证其安全性和有效性，但目前这一检测标准还未能提出。其次，由多能干细胞分化得到的角膜上皮样细胞应用的临床适应证、疗效评价、移植术前术后患者的治疗及管理、并发症的处理等问题，都还缺乏有效的共识，需要将来在临床应用中逐渐摸索。再次，干细胞的培养、鉴定需要严格无菌的环境、专业的技术人员，多数医院无法达到此要求，建立几个覆盖全国的干细胞中心进行标准化的干细胞培养和分化能解决此问题，但需要探索干细胞在储存、运输过程中如何保证其原有的生理特性。

七、总结

利用多能干细胞来源的角膜上皮样细胞治疗眼表损伤及相关疾病，将有效解决临床移植供体材料短缺的问题。看到在这一领域已经取得巨大进展，甚至有少量临床前期和相关研究的尝试，但也应注意到在真正应用于临床前仍有上述许多问题需要解决。由于角膜相对结构简单、位置表浅、不易发生排斥反应、易于移植手术操作等特点，使其有希望成为首批干细胞治疗的应用领域，不仅为无数眼表疾病患者带来光明的希望，也将成为再生医学重要的里程碑。

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Research progress on differentiating pluripotent stem cells into corneal epithelium

WangZhenyu1，2， Zhou Qingjun2， Shi Weiyun2. 1The Medical College of Qingdao University， Qingdao 266071， China；2Shandong Eye Institute， Shandong Academy of Medical Sciences， Qingdao 266071， China
Correspondence author： Shi Weiyun， Email： weiyunshi@163.com

Many patients suffer visual impairments because of ocular surface diseases. The cornea or limbal stem cells transplantation is the main treatment for these people， but the treatment is limited by the shortage of donor cells. Due to the great progresses in the research of pluripotent stem cell differentiation， corneal epithelium derived from pluripotent stem cells becomes a solution to this issue. In this review， we summarize recent advances in the enrichment and purification of differentiated cells， and discuss the problem of tumorigenicity， immunological rejection and clinical uses.

Stem cell； epithelium，corneal； cell differentiation；transplantation； limbus corneae

2015-06-08）

（本文编辑：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2015.04.009

973国家重点基础研究发展计划（2013CB967004）

266071，青岛大学医学院1；266071 青岛，山东省医学科学院 山东省眼科研究所2

史伟云，Email：weiyunshi@163.com