抗瓜氨酸蛋白抗体在类风湿关节炎中的研究进展

朱林文思

抗瓜氨酸蛋白抗体在类风湿关节炎中的研究进展

朱林文思

类风湿关节炎（RA）是一种常见的慢性自身免疫病，主要表现为炎症和关节损伤。RA的早期诊治能避免病情加重和关节不可逆损伤。1988年首次发现RA患者体内存在抗瓜氨酸化蛋白抗体（ACPA）［1］。2000年国外学者成功合成人工抗原环瓜氨酸肽（CCP），并利用ELISA方法在RA患者体内检测到抗CCP抗体，此后大量研究结果显示抗CCP抗体对RA具有较高的敏感性和特异性。2010年ACPA被美国风湿病学会（ACR）/欧洲抗风湿病联盟（EULAR）纳入RA诊断标准。ACPA存在于RA临床发病之前，并与RA病情的进展和预后明显相关。

1　抗瓜氨酸蛋白抗体的生成

瓜氨酸化蛋白是蛋白质翻译后修饰的一种形式。在Ca2+浓度＞10-5mol/L的条件下，肽酰基精氨酸脱亚氨酶（PAD）催化蛋白中的精氨酸残基脱亚氨基，转变为瓜氨酸残基，这种改变导致蛋白质随带正电荷减少，蛋白质分子内部结构发生变化，使原本隐藏于分子内的基团暴露，被吞噬清除，加速细胞死亡。此过程只出现在凋亡或坏死的细胞内，一般并不会引起免疫系统反应。但当清除系统无效或能力不足时，PAD酶和瓜氨酸蛋白就引起免疫反应。被释放的PAD酶，主要是PAD2和PAD4酶，其修饰关节滑膜组织中的胶原和纤维蛋白原含有的精氨酸蛋白，产生大量的多样化的瓜氨酸抗原［2］。因此在导致大量细胞死亡的炎症反应过程中，均可检测到瓜氨酸蛋白抗原，与是否RA有关。然而，在正常人体内瓜氨酸蛋白质的少量存在极少诱导机体产生ACPA，而在RA患者中则较为常见，此抗体的产生与患者的遗传背景和环境因素有明显关系。

2　影响抗瓜氨酸蛋白抗体产生的因素

根据ACPA产生的途径，T细胞对抗原表位的识别，B细胞的活化，PADI4酶的活性以及全身免疫反应水平等的改变均可以影响抗体的产生。一般认为ACPA的产生由遗传背景和环境因素两方面所影响。

2.1遗传背景 研究证明，HLA-DR4分子提供抗原至CD4+的T细胞过程系RA关节炎症启动的主要环节，活化的免疫活性细胞产生大量的细胞因子，如IL-1，IL-6和TNF-α，这些细胞因子可刺激成纤维细胞、上皮组织及间质细胞释放基质金属蛋白酶而破坏结缔组织，刺激上皮细胞上调粘附分子（ICAM-1及VCAM-1）的表达，促使炎性细胞侵入关节滑膜而发生免疫反应［3］。

HLA-DRB1基因对RA遗传易感影响力约30%［4］，其β链存在一段共同序列（QK/RRAA），称为RA共同表位（SE），是HLA-DRB1抗原结合槽的主要构成序列。自身抗原可能通过与该抗原结合槽结合而被递呈。抗CCP抗体的产生是受HLA限制性的，瓜氨酸化修饰的酶PADI4的某些SNPs基因型与RA的发生有关［5］。Hill等［6］研究证实肽链精氨酸转化为瓜氨酸后增加了与HLA-DRB1 SE的亲和力，进而诱导T细胞成熟，辅助B细胞的分化和成熟，产生ACPA。以瓜氨酸化纤维蛋白原免疫DR4.IE转基因鼠可产生关节炎，而非瓜氨酸化纤维蛋白原或免疫野生型C57BL/6则不能。

蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22（PTPN22）是编码淋巴特异性蛋白酪氨酸磷酸酶（LYP）的基因。LYP在维持细胞免疫稳态中起关键作用。研究显示PTPN22（R620W）与ACPA阳性RA相关［7］。ERBB3是表皮生长因子（EGF）受体酪氨酸激酶家族成员。ERBB3位于在CD11c+细胞（单核细胞和树突状细胞），参与抗原递呈，激活T细胞的增殖。近期研究显示，ERBB3基因中rs2271189与RA的发病有正相关性［8］。由于各种群存在基因背景差异，不同种族背景ACPA阳性人群的基因也有所不同。研究中发现［5］，日本人染色体lp36上的NT2034367.1区域的4个PADl4基因的SNP外显子SNP（PADl4-89、PADl4-90、PADl4-92、PADl4-104）单倍体型与RA易感性相关。在日本和韩国等亚裔的报道中也证实上述结果。但在欧美裔人群却发现虽存在SNP多态性，却与RA易感性无关。汉族人群有报道SNP（PADl4-89、PADl4-90和PADl4-104）与RA易感性相关［9］。同时发现中国人RA滑膜中PADl4 mRNA高水平转录。但也有研究者认为只有2个SNP（PADl4-89和PADl4-104）与RA易感性相关［10］。同时携带SE和PABl4-89 G+、PADl4-92 G+和PADl4-104T+中任一个SNP少见基因型均明显增加发生RA的风险性［7］。提示两者可能存在一定协同作用。

2.2环境因素 研究显示基因和环境因素相互作用与RA发病相关［11］。烟草暴露（TE）是RA众所周知的主要环境危险因素。且开始TE年龄及TE年数与RA有关，TE年龄越早，TE年数越长，患RA的危险性越大。不仅因TE在整体上危害身体健康，TE还与ACPA的产生相关。SE、TE和ACPA抗体的关系是通过CD4+T细胞的作用，影响瓜氨酸化蛋白介导的B细胞，从而影响ACPA的水平［12］。研究显示，TE仅在带SE的患者中是危险因素。TE可能触发针对瓜氨酸蛋白的免疫反应，可能是通过诱导瓜氨酸化支气管肺泡的受损细胞［13］。一旦对瓜氨酸化蛋白的耐受被打破，TE就可通过T细胞或B细胞免疫反应识别其他HLA分子。比较健康TE者和肺炎TE者的支气管肺泡细胞可知，TE可以增加肺中PAD表达，并从而增加瓜氨酸化蛋白质［14］。此外TE和牙龈卟啉单胞菌感染等可造成携带SE的RA易感者初始炎症，导致含PADl4的细胞凋亡或凋亡过程中钙离子内流，激活PADl4催化细胞内自身抗原瓜氨酸化并外溢，从而打破耐受。

在其他方面，鱼中ω-3脂肪酸有助于防止RA的发生，改善症状。潮湿的环境与RA的发病有关，寒冷和潮湿作为一种全身刺激因子，作用于具有某些遗传特征的免疫系统，使其发生功能改变，从而促使RA发病。另外，寒冷和潮湿作为不良的环境因素，可能诱发或加剧某些致病因子的作用，通过自身免疫机制发生RA。此外研究显示，初潮年龄越大，发病的危险性越大。目前认为，女性激素可能为RA发病的保护因素，表现在妊娠期RA病情的缓解及口服避孕药的妇女RA发病率较低。初潮年龄晚也可使女性激素处于较低水平而增加RA发病的危险性，同理绝经的时间对RA的发病无影响［15］。

3　抗瓜氨酸蛋白抗体种类

2010年，ACPA被美国风湿病学会（ACR）/ 欧洲抗风湿病联盟（EULAR）纳入RA诊断标准。检测ACPA的方法主要是通过不同瓜氨酸表位，将不同种类的瓜氨酸抗原作为底物进行检测。抗核周因子（APF）抗体是最早发现的ACPA抗体，早在1964 年首次发现，特异性为89% ～ 94%，敏感性为50% ～ 80%。1979 年，抗角蛋白抗体（AKA）被首次发现，在此后的试验中发现AKA的靶抗原是角质层的丝聚蛋白，此抗体特异性94% ～ 98%，敏感性40% ～ 60%。此外，还有抗聚角微丝蛋白抗体（AFA）和抗瓜氨酸化纤维蛋白原（ACF）抗体等多种抗体。日前，最为广泛使用的是抗环瓜氨酸肽（CCP）抗体，而抗瓜氨酸波形蛋白（MCV）抗体和抗病毒瓜氨酸肽（VCP）抗体也较为常见。

3.1抗环瓜氨酸肽（CCP）抗体 2000年，国外学者成功合成人工抗原环瓜氨酸肽（CCP），并利用ELISA方法在RA患者体内检测到抗CCP抗体，大量研究结果显示抗CCP抗体对RA具有较高的敏感性和特异性。2002年至今最广泛使用的ACPA为第二代CCP抗体。研究显示，CCP2抗体的特异性达96%，敏感性72%。约50% ～ 70%的早期RA患者抗CCP2抗体阳性［16］，且表型非常稳定，治疗后几乎无患者由阳性转为阴性。相对RF而言，CCP2抗体特异性更高，仅约1%～2%的健康人CCP2抗体阳性，仅少数的相关疾病如系统性红斑狼疮（SLE）［17］，混合型结缔组织病（MCTD），肌炎等可能有抗CCP2抗体阳性，这些抗体阳性率约10%。而这些患者，通常也表现出类似RA的症状，如多发性关节炎等，或同时伴发RA。多数研究表明CCP3的检测针对多种瓜氨酸表位抗原，在多数早期RA患者体内存在抗CCP3联合表位的抗体，其特异性93%，敏感性74%，与CCP2相比无优势。但在RF阴性的RA患者中，第3代CCP抗体被认为有更好的普适性［18］。

3.2抗突变型瓜氨酸波形蛋白（MCV）抗体 波形蛋白是一类存在于细胞质中的中间纤维丝蛋白，包含43个精氨酸残基。该蛋白主要由滑膜微环境分泌，是表达在滑膜组织中的一类相关自身抗体［19］。抗MCV抗体比抗CCP抗体能更好地预测RA患者关节损伤情况。在RA和其他系统风湿性疾病的区分中，抗MCV抗体表现出更好的敏感性和特异性［20］。抗MCV抗体已经被证实是一种更为敏感的ACPA的抗原性靶点，但特异性低于抗CCP2抗体［21］，两者联合检测可以将敏感性提升至85%。

3.3抗病毒瓜氨酸肽（VCP）抗体 近年来，有研究显示一种新型病毒瓜氨酸肽（VCP）可用于辅助RA的诊断。VCP包括VCP1和VCP2，分别来自EB病毒编码的EBNA-1蛋白和EBNA-2蛋白。抗VCP2抗体特异性95%，敏感性61%。抗CCP抗体阴性的RA患者中VCP1阳性1%，而VCP2阳性4%。反之，在VCP抗体阴性的RA患者中3%为抗CCP抗体阳性［22］。由此可见，抗VCP抗体和抗CCP抗体联合检测有助于ACPA抗体的检测。

4　抗瓜氨酸抗体在RA中的作用

大量研究显示ACPA的出现早于RA临床发病，同时ACPA表位扩展和疾病的发展有关。在RF或SE阴性而ACPA或抗CCP抗体阳性的关节痛患者可以预测其可能会发展为关节炎［23］，在这过程中其血清内可测得的APCA表位和水平均会有明显的提升，这显示瓜氨酸化可能参与ACPA阳性RA的发展。研究显示，在实验动物模型中ACPA不仅可以诱导还可以恶化关节炎。给II型胶原诱导性关节炎小鼠模型注射瓜氨酸化纤维蛋白原单抗可以使其病情加重。但对照组中，无关节炎的动物则不会引起关节损伤。此外瓜氨酸化II型胶原或瓜氨酸化纤维蛋白原，可以诱导炎症性关节炎实验小鼠模型［24］。

在体外模型中，ACPA相关的免疫复合物可以通过FcγRIIa与人类巨噬细胞结合，从而促进肿瘤坏死因子的分泌。ACPA阳性的RA患者的滑膜炎损伤速度比ACPA阴性的患者更快［25］。在体外，ACPA能通过经典途径和旁路途径激活补体系统，证明其在病理生理方面参与RA的病程［26］。这些均证实瓜氨酸化加强局部炎症反应和损伤。虽然具体机制尚未明确，但目前研究显示RA发病由瓜氨酸抗原抗体介导。

目前研究表明，ACPA阳性和阴性是两种有着明显不同的危险因素的RA亚群，这两个亚群可视为具有不同病理生理基础的两个独立的疾病。功能学研究显示ACPA阳性RA，能产生CCP抗体；在实验鼠模型中，显示CCP抗体可以诱导并且促进关节炎［27］。不同发病机制的疾病有可能会受益于不同的治疗策略。由于ACPA可能与ACPA阳性RA患者病情发展密切相关，目前主要使用抗风湿药物（DMARDs）中，有些药物的靶点在于降低ACPA的水平。如甲氨蝶呤目前被广泛用于治疗风湿性关节炎和其他炎症性疾病。甲氨蝶呤可以有效减缓ACPA阳性未分化关节炎患者转变为RA，但对于ACPA阴性的患者无效［28］。不仅是甲氨蝶呤疗效不同，临床试验显示，在难治性RA中，利妥昔单抗在ACPA阳性患者中疗效比阴性患者更好。

5　小结

ACPA是继RF后RA诊断中的最重要标志性自身抗体，与RF相比具有更高的敏感性和特异性。ACPA与遗传因素和环境因素共同影响有关，大量研究显示，ACPA的出现早于RA临床发病，其不仅是RA发病的潜在危险因子，还加速RA的恶化。因此早期检测未分化关节炎患者体内的APCA水平，可以提前干预，延迟甚至可能阻止RA的出现。目前最常用的检测ACPA方法为针对抗CCP2抗体的检测，此外还有针对CCP3、MCV、VCP抗体等多种方法，虽然后者无法在敏感性和特异性两方面优于CCP2，但联合检测将有助于ACPA抗体的检出率。

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200025 上海交通大学医学院