不同液体容量复苏对大鼠内毒素性急性肺损伤的防治作用及机制探讨

陈娜，王树影，裴凌

(中国医科大学附属第一医院，沈阳110001)

急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是由心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性、进行性呼吸衰竭，病死率为30% ～40%，严重威胁患者的生命［1］。引起 ALI的原因有多种，其中内毒素是导致ALI的重要致病因子［2］。研究［3］表明，在失血性休克和感染引起的ALI动物模型中，羟乙基淀粉能减轻肺组织的炎症反应。高渗氯化钠羟乙基淀粉40注射液是一种高渗晶胶混合液，在补充血容量方面能发挥很好作用。本研究观察了不同液体容量复苏对大鼠内毒素性ALI的防治作用，并探讨其可能机制，旨在为临床ALI患者液体的选择提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠50只，体质量250～300 g，6～8周龄。采用随机数字表法将50只大鼠分为A、B、C、D、E组各10只。

1.2 主要试剂及仪器 内毒素(Sigma公司，美国);氯化钠溶液(华仁药业有限公司);6%羟乙基淀粉130/0.4溶液(Fresenius Kabi公司，德国);高渗氯化钠羟乙基淀粉40溶液(上海华源长富药业有限公司);TNF-α试剂盒(Cloud-clone公司，美国);肺表面活性蛋白-D(SP-D)试剂盒(Cloud-clone公司，美国);DFC450光镜(200×，Leica公司，德国)。

1.3 内毒素性ALI模型制备及液体容量复苏 A、B、C、D组大鼠麻醉采用腹腔注射10%水合氯醛5 mL/kg。常规备皮消毒后做气管切开，保留自主呼吸，行面罩吸氧，氧浓度为60%，流量2 L/min。游离一侧股动、静脉，分别行穿刺置管术，静脉用于给药和补液，动脉用于采血及通过换能器与多功能监测仪相连监测平均动脉压(MAP);参照文献［4］介绍的方法制备内毒素性ALI模型，5 mg/kg内毒素溶于0.5 mL生理盐水中经股静脉缓慢注射1 min。E组给予等量生理盐水。以氧合指数≤300 mmHg时为模型制备成功［5］，后开始液体容量复苏，并将此时作为零时，分别经股静脉注入高渗氯化钠羟乙基淀粉40溶液(A组)、氯化钠溶液(B组)、6%羟乙基淀粉130/0.4溶液(C组)，以15 mL/kg恒速输注6 h;D组不注入任何液体，E组注入等量生理盐水。

1.4 观察方法 记录注射内毒素前及液体复苏1、3、6 h各组MAP变化。于液体复苏6 h时采集股动脉血0.3 mL进行血气分析，记录PaO2、乳酸(Lac)水平，计算氧合指数。于上述时点另取血1.2 mL，4℃下以3 000 r/min离心10 min，取上清，－80℃保存。采用ELISA方法测定TNF-α、SP-D，操作按试剂盒说明书进行。容量复苏6 h后处死大鼠，即刻开胸，结扎左主支气管，取下左肺，用蒸馏水冲洗肺表面血液，滤纸吸干表面水分，用电子分析天平称肺湿重(W)，后置于80℃恒温烤箱48 h，取出称干重(D)，计算湿/干重(W/D)值。在大鼠左肺取出后，即刻行右肺内灌注和内固定，取下右肺上叶，放入4%多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋、切片(4 μm)、脱蜡、苏木素伊红(HE)染色、封片后在DFC450光镜下观察肺组织病理形态变化。按照Mikawa等［6］的方法从四项指标进行肺损伤评分:①肺泡充血;②出血;③间隙或血管壁中性粒细胞浸润或聚集;④肺泡间隔增厚或透明膜形成;根据每项指标病变轻重进行0～4分半定量分析(0:无或极轻微损伤;1:轻度损伤;2:中度损伤;3:重度损伤;4:极重度损伤)，累加各项评分的总分作为ALI的病理评分。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠不同时点MAP水平比较 结果见表1。

表1 各组大鼠不同时点MAP水平比较(mmHg，±s)

表1 各组大鼠不同时点MAP水平比较(mmHg，±s)

注:与E组比较，*P＜0.05;与 D组比较，#P＜0.05;与 B组比较，ΔP ＜0.05。

组别MAP注射内毒素前 液体复苏1 h 液体复苏3 h 液体复苏6 h A组 105±5 88±3*#Δ 82±2*#Δ 79±4*#Δ B组 102±6 76±4*# 65±4*# 56±3*#C组 103±8 88±5*#Δ 80±3*#Δ 79±4*#Δ D组 101±7 65±6* 54±5* 42±7*E组103±3 103±5 101±5 100±4

2.2 各组大鼠W/D值、肺损伤评分、PaO2、氧合指数及TNF-α、SP-D、Lac水平比较 结果见表2。

2.3 各组大鼠肺组织病理形态学变化 E组肺组织结构完整，肺泡腔中无渗出液或渗出的中性粒细胞;D组双肺明显水肿，肺泡结构完整性遭到严重破坏，弥漫性中性粒细胞渗出、聚集;B组肺组织破坏严重，大量中性粒细胞浸润，肺泡腔内可见渗出液;C组和A组肺组织结构基本完整，出血和中性粒细胞浸润情况较B组明显减轻。

表2 各组大鼠W/D值、肺损伤评分、PaO2、氧合指数及TNF-α、SP-D、Lac水平比较(±s)

表2 各组大鼠W/D值、肺损伤评分、PaO2、氧合指数及TNF-α、SP-D、Lac水平比较(±s)

注:与 E 组比较，*P ＜0.05;与 D 组比较，#P ＜0.05;与 B 组比较，ΔP ＜0.05;与 C 组比较，☆P ＜0.05。

组别 W/D值 肺损伤评分(分) PaO2(mmHg) 氧合指数(mmHg)TNF-α(pg/mL) SP-D(ng/mL) Lac(mmol/L)A 组 4.54 ±0.14*#Δ 3.7 ±1.5*#Δ 129 ±16*#Δ 215 ±27*#Δ 32.4 ±1.2*#Δ 31.6 ±2.3*#Δ 2.52 ±0.19*#Δ☆B 组 5.08 ±0.09*# 10.1 ±2.3*# 92 ± 6*# 154 ± 9*# 52.6 ±3.1*# 47.3 ±1.7*# 3.90 ±0.21*#C 组 4.56 ±0.13*#Δ 4.9 ±1.5*#Δ 132 ±16*#Δ 219 ±27*#Δ 34.1 ±1.3*#Δ 32.2 ±2.6*#Δ 3.29 ±0.23*#Δ D 组 5.97 ±0.16* 11.3 ±1.2* 73 ± 4* 122 ± 8* 64.2 ±2.4* 69.5 ±3.6* 4.72 ±0.25*E 组 4.08 ±0.08 0.5 ±0.5 207 ± 6 346 ±10 24.0 ±0.7 13.9 ±1.1 1.65 ±0.21

3 讨论

ALI/ARDS可由直接肺损伤(如肺炎、胃内容物的吸入和有毒物质的吸入)和间接肺损伤(如脓毒血症、创伤性休克、输血和急性胰腺炎)引起，其中最常见的原因是细菌或病毒性肺炎［7］。ALI/ARDS患者的病死率极高，需要积极治疗。目前认为，液体治疗是肺损伤治疗的第一步，也是最基本的治疗方案。相对于晶体，胶体能有效提高血浆胶体渗透压，维持血容量。在ALI早期，机体处于低心排血量和低灌注状态，采用积极地液体复苏策略可以补充血容量，增加心排血量，改善组织灌注。

ALI/ARDS患者由于弥漫性肺微血管内皮细胞损伤常导致肺组织水肿，从而表现为顽固性低氧血症和血流动力学不稳定状态。本研究显示，E组大鼠各时点MAP平稳，PaO2、氧合指数正常;D组大鼠在给予内毒素后随着时间延长MAP、PaO2和氧合指数进行性下降;而A、B、C组大鼠MAP、PaO2和氧合指数尽管也有下降，但与D组比较，下降程度得到改善，尤其是A、C组。A、B、C组W/D值明显低于D组，尤其是A、C组。上述结果说明，上述三种液体(尤其是后两种)均可以逆转内毒素引起的MAP、PaO2和氧合指数下降，减轻肺组织水肿，改善大鼠组织氧供，使大鼠血流动力学更加稳定，从而有可能减少其他并发症的发生。

SP-D主要由肺泡Ⅱ型上皮细胞合成并分泌至肺泡表面，有助于维持肺组织表面活性物质水平的稳定，参与免疫防御和下调炎症反应，因此其在ALI/ARDS的发生发展中发挥着重要作用［8，9］。动物实验表明，内毒素导致的ALI模型，在SP-D缺乏型小鼠和SP-D正常型小鼠的对比研究中，SP-D通过抑制粒细胞巨噬细胞刺激因子途径，抑制外周单核/巨噬细胞向肺内迁移，从而抑制炎症反应［10］。Liu等［11，12］将人类 SP-D 重组体作用于变应原攻击后的小鼠，发现SP-D能抑制TNF-α的产生，其机制可能是SP-D作用于CD14/toll样受体，阻断病原体的刺激而发挥抗炎作用。在内毒素诱导的ALI动物模型中，将含有SP-D的肺表面活性物质注入气管后，电镜观察到肺泡巨噬细胞的溶酶体结构内含有SP-D与内毒素的聚集体，结果表明SP-D能减轻内毒素的损伤，阻止肺损伤的发生和发展［13］。ALI/ARDS发生后，肺毛细血管膜完整性遭到破坏，通透性增加，导致肺泡表面的SP-D向血管内渗漏，使肺内 SP-D 水平明显减少［14］。研究［15］显示，油酸注入肺泡后4 h(病理证实有呼吸道、肺泡损伤及肺水肿，但可以认为无肺泡Ⅱ型上皮细胞增生)测得血清SP-D水平明显升高。由此SP-D可以作为肺泡上皮细胞损伤、肺毛细血管通透性改变的生物学标记物之一，因此监测血清SP-D变化有利于指导治疗、改善ALI/ARDS患者的预后。TNF-α是单核细胞产生的一种重要的炎性因子，机体在创伤、烧伤和大手术等打击后，体内免疫细胞处于被激活状态，首先肺巨噬细胞被激活，释放大量的前炎症细胞因子，如IL-1和TNF-α，这两种多功能的因子作用于中性粒细胞(PMN)和其他细胞。当PMN被激活时，能产生和释放活性氧，通过氧化细胞膜脂质直接损伤肺泡上皮细胞和内皮细胞，同时PMN还可合成并释放TNF-α、IL-1等多种炎性因子，导致肺组织损害加重。

本研究显示，氯化钠溶液、6%羟乙基淀粉130/0.4溶液和高渗氯化钠羟乙基淀粉40溶液均能降低内毒素性ALI大鼠血清SP-D水平，且与肺组织病理变化和血清TNF-α水平变化相一致，而两种胶体液的容量复苏效果更加显著，其机制可能是它们能有效维持肺内SP-D水平，调节SP-D炎症抑制作用。虽然C组和A组肺损伤程度无显著性差异，但A组Lac水平低于C组，而对Lac水平的连续监测可以评价ALI/ARDS的严重程度和判断预后状况，因此高渗氯化钠羟乙基淀粉40溶液更适合内毒素性ALI的早期容量复苏。

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