一株兔源地衣芽孢杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

2015-01-21崔荷枫周峻明张博宣刘恬麟姚贝贝

饲料工业 2015年8期

■魏振柯静崔荷枫周峻明张博宣刘恬麟兰月姚贝贝龙淼

（沈阳工学院生命工程学院，辽宁抚顺 113112）

芽孢杆菌属的一些菌株对动物和人类具有广泛的作用而被认为是益生菌[1]。芽孢杆菌最重要的特性是其在一定条件下形成芽孢，具有稳定性和不易丧失活性。芽孢杆菌属的一些菌株在哺乳动物的粪便和回肠内均被检测到[2-4]。芽孢杆菌的最基本特性包括它能够在肠道存活并繁殖，形成芽孢，并分泌一些抗菌物质[5-6]。芽孢杆菌的一些菌株被欧洲食品安全局授权可以作为微生态制剂添加于饲料和食品中，如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌被认为是安全有效的菌株[7]。这些菌株具有促进生长、促进饲料利用率和促进消化系统的健康等作用。这主要与其产生多种蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等生物活性物质有关，同时还可产生多种抗菌物质，这些抗菌物质对细菌、病毒、真菌等都有抑制作用，其微生态制剂在医药和畜牧养殖方面有较高的应用价值[8]。

地衣芽孢杆菌是芽孢杆菌中较具应用潜力的菌种之一。地衣芽孢杆菌在植物病害防治、饲料加工、医药开发、环境污染治理等方面具有广泛的应用[9]。目前很多芽孢杆菌已从很多种动物肠道中分离鉴定出来，并作为微生态制剂应用于猪[10-11]、牛[12-13]、羊[14]、家禽[15-16]、家兔[17-18]等动物上，作用效果也已得到证实。由于菌株的来源不同、生存环境不同，从不同动物胃肠道分离鉴定的菌株，最好应用于其来源相同的动物上，才能发挥其最高的生物学活性。因此，本试验拟通过家兔肠道分离鉴定出具有益生作用的芽孢杆菌菌株，初步研究其生物学特性，进而为研制家兔微生态制剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

PCR Mix试剂盒、Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒购自上海生物工程技术有限公司，PCR引物由上海生物工程技术有限公司合成，LB固体培养基、LB液体培养基及改良GAM肉汤购自青岛海博生物技术有限公司；生化试剂、微量生化管等均购自杭州天和微生物试剂有限公司；革兰氏染色液（自配）；家兔购自沈阳某养殖场。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌分离

无菌采取家兔肠道内容物，分段收集肠道内容物（十二指肠、空肠、回肠和盲肠），用无菌棉签沾取肠道内容物，迅速将其加入到含有20 ml灭菌水的灭菌三角瓶内，摇动片刻，然后小火加热至悬液沸腾，维持2 min。而后静止5 min，吸取上层液0.1 ml，涂布于LB固体培养基，用封口膜将平皿封好，倒置于厌氧培养罐中，迅速放入厌氧袋并盖好盖，厌氧培养48 h，挑取单菌落，于改良GAM肉汤进行厌氧培养，观察培养特性，进行革兰氏染色，选取疑似芽孢杆菌的菌株进行生理生化鉴定和分子生物学鉴定。

1.2.2 生化鉴定

将改良GAM肉汤培养物转移接种于生化反应管，根据杭州天和微生物试剂有限公司《细菌微量生化反应管使用说明书》观察反应结果。主要鉴定项目：耐盐能力测定、运动性测定、需氧性测定、油脂水解试验、酪素水解试验、亚甲基蓝还原试验、V-P试验、淀粉水解试验、明胶液化试验、葡萄糖发酵试验、过氧化氢试验、氧化酶试验。

1.2.3 16S rRNA序列测定及同源性分析

16S rRNA序列引物采用通用引物：采用通用引物：27f：5’-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3’；1492R：5’-TACCTTGTTACGACTT-3’；分离株进行基因组DNA提取，基因组DNA的提取采用生工柱式细菌基因组提取试剂盒进行提取，操作方法按照说明书进行。PCR反应，以提取的菌株基因组为模板，进行PCR扩增16S rRNA序列，体系为30 μl体系模板1 μl，上游引物和下游引物各1 μl，PCR Mix 15 μl，剩下由无菌水补足。反应条件：PCR条件：95℃5 min，94℃ 40 s，54℃ 40 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃5 min，4℃结束。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。测序由上海生物工程技术有限公司纯化和测序。序列的数据处理。测序结果在NCBI使用Blast比对，从GenBank数据库中获得与菌株16S rDNA源的公认标准序列数据，使用Clustal X 1.8把不同的序列对齐后，使用 DNAman5.1构建菌株的系统进化树。

1.2.4 耐酸性试验

将 100 ml/瓶的改良GAM肉汤用0.10 mol/l的盐酸调 pH 值分别为 2、3、4，分别取 5 ml分装于试管中，每个梯度做两个平行，121℃灭菌15 min冷却，接种活化的体积分数为10%的地衣芽孢杆菌菌液，37℃恒温培养每隔2 h用无菌生理盐水以10倍依次递减稀释，进行平板菌落计数，测0～6 h的活菌变化情况。

1.2.5 耐高温试验

将GAM肉汤中的芽孢杆菌生长末期已完全形成芽孢的培养物分别在 60、70、80、85、90、95、100、121℃水浴中处理后，迅速流水冷却，然后采用稀释平板法测定芽孢存活率[19]。

1.2.6 耐胆盐试验

在LB液体培养基中加入猪胆盐，使其质量分数分别为0、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%，121℃、15 min灭菌备用，菌种按体积分数为10%的接种量接种，37℃厌氧培养，观察菌体生长变化情况[19]。

1.2.7 安全性检测

进行动物试验，采用腹腔注射法：刮取平板上纯培养的菌苔，以无菌生理盐水制成浓度为5.0×109CFU/ml的菌悬液，设置空白组合对照组，每组共10只小鼠。每只健康成年昆明小鼠一次性腹腔注射0.3 ml，连续观察7 d。记录观察期间小鼠中毒表现及死亡情况，如与对照组相比未观察到受试小鼠有毒性反应及引起死亡，则判定待检菌株无毒性。

2 结果

2.1 形态学特征

菌株在GAM培养基上生长良好，24 h形成直径为4～5 mm左右大小的圆形菌落，白色而有光泽，表面湿润、平坦、边缘整齐，如图1。油镜观察：24 h后进行镜检，菌株菌体形态为长杆状，单个、成对或链状排列，如图2所示。

图1 WZ01在GAM固体培养基上培养24 h菌落形态

图2 WZ01菌株镜检涂片(10×100倍)培养48 h

2.2 生理生化特征

生理生化鉴定见表1，将上述鉴定结果与《伯杰氏细菌鉴定手册》上关于芽孢杆菌的描述及其他一些生化特性相对照，该分离株可初步判定为地衣芽孢杆菌。

表1 WZ01生理生化鉴定结果

2.3 16S rRNA序列测定及同源性分析结果

测序结果表明，所用引物所扩增的菌株WZ01的16S rRNA片段长度为1 452 bp（见图3）。16S rRNA基因测序结果已呈送GenBank数据库中并被收录，收录号为：KP696780。用BLAST进行序列比对，结果表明：分离菌株与GenBank中发表的Bacillus licheniformisstrain NJ-5（登录号FJ435674.1）和Bacillus licheniformisstrain CCMMB907（登录号KF 879261.1）16S rRNA同源性均达到99%。用DNAStar软件对WZ01菌株基因与GenBank中已公布的序列比对分析，生成系统发生树，由图4和图5可知，WZ01菌株与Bacillus licheniformisstrain 2-20菌株属于同一分支，核苷酸同源性最高，达到99.6%，与另一分支的地衣芽孢杆菌DHXJ13、bC37、D50的核苷酸同源性分别为98.8%、99%和99.4%。确定分离菌株为Bacillus licheniformis，命名为Bacillus licheniformisWZ01。

2.4 耐酸性试验结果

微生态制剂要发挥益生作用就必须通过胃部、进入肠道，胃液中含有酸及各种酶类，检验益生菌株对酸性耐受性非常必要。人和动物空腹时胃液的pH值在0.9～1.8之间，进食过程中在1.8～5.0之间波动，通常维持在3.0左右。将菌株在不同酸性培养液中培养，每隔0.5 h取样测定活菌数，结果如表2所示，结果表明，该菌株具有很强的耐酸性。

图3 WZ01菌株PCR电泳图

图4 WZ01基因系统发生树

图5 WZ01菌株与参考株序列同源性分析

表2 WZ01酸耐受能力（lgN/ml)

2.5 耐高温结果

如图6所示，菌株WZ01具有一定的耐热性，但是相对较差，当处理温度低于80℃时，芽孢存活率保持100%，而随着处理温度的进一步上升，芽孢存活率则急剧下降，100℃处理15 min后，存活率仅为4.5%，在121℃处理14 min存活率为0。

图6 温度对WZ01菌株活性的影响

2.6 胆盐耐受性

益生菌对于胆盐的抗性是其能够在肠道存活、生长并发挥功效的先决条件之一。胆盐对菌株的抑制作用取决于胆盐的浓度和菌株本身的特性,动物小肠中胆盐质量分数在0.03%～0.3%之间波动。能够在正常生理胆盐浓度中生长和代谢的菌株才可能在肠道消化过程中存活，结果见表3。WZ01在猪胆盐浓度为0.30%时还能够生长，具有优良的耐胆酸盐能力。

表3 WZ01在不同浓度胆盐中的生长情况

2.7 安全性检测

对腹腔注射的昆明小鼠连续观察7 d并未见到中毒症状及死亡情况。剖检后也未见任何病理变化，未从各脏器培养出该菌。各对照组均正常。试验结果表明，所分离芽孢杆菌菌株没有致病性。

3 讨论

近年来，不少研究学者从土壤、粪便及不同动物肠道中分离鉴定出地衣芽孢杆菌，但从家兔肠道中分离鉴定出地衣芽孢杆菌并研究其生物学特性还尚未见报道。本研究结果可以进一步证实，家兔肠道中存在地衣芽孢杆菌。但从家兔肠道内分离鉴定的地衣芽孢杆菌在家兔肠道是常在菌还是路过菌及在兔肠道内主要的功能还有待于进一步研究。肉兔消化系统和免疫系统不同于猪、牛、羊、家禽，有它固有的消化生理特点和免疫特性[17]，因此，进一步需研究其对肉兔肠道发育、免疫功能、生长性能等影响，为其进一步推广应用提供理论参考与科学数据。