酵母水解物对大菱鲆幼鱼非特异性免疫及抗应激能力的影响

■柳 茜 杨文娇 吴 振 梁萌青 郑珂珂 牟玉超

（1.中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛 266071；2.唐山拓普生物科技有限公司，河北唐山 063021）

酵母水解物（Autolzed Yeast），是采用新鲜啤酒酵母为原料，采用现代生物工程技术，经除杂、自溶、酶解、喷雾干燥等工艺精制而成。酵母水解物富含核酸、核苷酸、小肽、细胞壁多糖（免疫多糖）、游离氨基酸及丰富的B族维生素[1-2]。氨基酸和小肽易于消化吸收，在动物蛋白质营养中优势显著，因此酵母水解物是一种非常理想的功能性蛋白源，可以作为饲料中优质蛋白原料（如鱼粉）的替代物[3-4]。此外，小肽可以加速蛋白质合成，提高动物机体免疫力[5]。核苷酸及B族维生素具有提高机体免疫力和抗氧化能力的作用[6-9]。酵母细胞壁多糖因其特殊构型，尤其啤酒酵母由于多代次的特殊优势，更厚的胞壁，提供更丰富的免疫多糖，易被免疫系统接受，激活机体巨噬细胞，并诱导机体产生一系列的细胞免疫和体液免疫反应，从而增强动物免疫力，改善其健康状况。目前，酵母或酵母提取物等作为蛋白质来源或饲料添加剂在淡水鱼（鲤鱼、丰鲤、淡水白鲳、鳊、草鱼、异育银鲫等）中的应用已有研究[10]，但是酵母水解物作为蛋白质来源或饲料添加剂在海水鱼中研究较少。

大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)是一种底栖的肉食性海水鱼类，是我国北方重要的海水养殖品种之一。目前，大菱鲆的基本营养需求已经明确，因此如何通过营养途径进行健康养殖逐渐成为人们关注的焦点。本研究利用以鱼粉、豆粕、玉米蛋白粉、谷朊粉和酵母粉为复合蛋白源配制的精饲料，探究酵母水解物对大菱鲆非免疫性免疫力及抗应激能力的影响，为酵母水解物在大菱鲆人工配合饲料中的应用积累资料。

1 材料与方法

1.1 试验用鱼

大菱鲆幼鱼购自青岛市通用水产养殖有限公司。试验开始前，停食24 h，随机挑选大小均匀、体格健壮且体表无病，平均体重(6.17±0.06)g的大菱鲆幼鱼360尾，随机平均分配到4×3个养殖桶（40 cm×50 cm×100 cm）中。

1.2 试验饲料

试验饲料原料购自青岛七好生物科技有限公司。饲料原料粉碎后，过80目筛网备用。以30%鱼粉组为对照组，以酵母水解物及酵母粉及植物蛋白分别替代10%、15%、20%鱼粉，配制成等氮、等能的4种试验饲料。试验饲料配方及营养成分见表1。

表1 试验饲料组成及营养成分分析

1.3 饲养管理

养殖试验采用流水培育，养殖水体水温(16±1)℃，pH值7.6～8.2，连续充氧，溶氧含量保持在6 mg/l以上。每天人工表观饱食投喂两次（6:30和16:30），投喂后0.5 h换水以排除残饵，试验为期8周。

1.4 样品采集与分析

试验结束后，饥饿24 h，称每桶鱼总重。然后每桶随机取6尾鱼，用1.0 ml一次性无菌注射器(含肝素钠)尾静脉采血，置于4℃冰箱过夜，在2 500 r/min离心10 min，分离血清，-20℃冰箱保存，待测；取肝脏，-20℃冷冻保存，待测；每桶随机捞取3尾鱼，用于常规分析。

血清溶菌酶（LZM）、肝脏酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、一氧化氮合酶（NOS）、肝脏总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性及肝脏丙二醛（MDA）含量均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。

1.5 抗应激试验

1.5.1 耐低氧能力测定

参照池田(1976)的方法进行，即饲喂结束24 h后，从各试验组分别随机捞取10尾供试鱼，放入盛有2.0 L养殖桶水的泡沫箱中。将全部鱼放入泡沫箱中后，开始计时并观察各组试验鱼的呼吸情况。待10尾试验鱼中的8尾停止鳃盖自主张合动作后，将其全部捞起放入原养殖桶中，连续充氧继续观察2.0 h，记录各试验组恢复自主呼吸的鱼体数量。根据各试验组鱼停止鳃盖自主张合时间和恢复自主呼吸的鱼体数量，评价各组鱼耐低氧的能力。

1.5.2 抗干旱能力测定

从各试验组中分别随机捞取10尾试验鱼，进行抗干旱能力的测定。具体做法是将捞起的试验鱼放在干燥的塑料筐中，连续观察鱼体的动态，待10尾试验鱼中的8尾停止鳃盖自主张合运动后，将其全部放入原养殖桶中，连续充氧继续观察2.0 h，记录各试验组恢复自主呼吸的鱼体数量。根据各组鱼停止鳃盖自主张合时间和恢复自主呼吸的鱼体数量，评价各组鱼抗干旱的能力。

1.5.3 抗低盐度应激能力测定

从各试验组分别随机捞取10尾供试鱼，放入盛有4 L淡水、连续充氧的泡沫箱中，将全部鱼放入泡沫箱中后，开始计时并观察各组试验鱼的呼吸情况。记录试验组和对照组鱼全部停止鳃盖自主张合的时间，评价试验组和对照组鱼的耐低盐能力。

1.6 数据分析

数据采用SPSS 17.0进行单因素方差分析（Oneway ANOVA），差异显著（P＜0.05）后，进行邓肯氏多重比较（Duncan's multiple range tests），所有试验数据采用“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 饲料中酵母水解物对大菱鲆幼鱼免疫相关酶活性的影响（见表2）

表2 酵母水解物对大菱鲆幼鱼免疫相关酶活性的影响

由表2可见，添加酵母水解物的各试验组血清溶菌酶（LZM）、肝脏酸性磷酸酶（ACP）和一氧化氮合酶（NOS）活性均显著高于对照组（P＜0.05）；YH-1组肝脏碱性磷酸酶活性高于对照组，但差异不显著（P＞0.05）；YH-2及YH-3组肝脏AKP活性显著高于对照组（P＜0.05）；且血清LZM、肝脏ACP、AKP和NOS活性随着酵母水解物的含量增加呈先上升后下降的趋势；YH-2组的LZM、AKP、NOS活性显著高于YH-1和YH-3组（P＜0.05）；YH-2组的肝脏ACP活性略高于YH-1和YH-3组，但差异不显著（P＞0.05）。

2.2 饲料中酵母水解物对大菱鲆幼鱼肝脏抗氧化能力的影响（见表3）

表3 酵母水解物对大菱鲆幼鱼肝脏抗氧化能力的影响

由表3可知，YH-1组肝脏总抗氧化能力(T-AOC)显著高于对照组（P＜0.05），YH-2、YH-3组T-AOC则显著低于对照组（P＜0.05）；添加酵母水解物的各试验组超氧化物歧化酶（SOD）活性均显著高于对照组（P＜0.05）；YH-2组的SOD活性显著高于YH-1、YH-3组；YH-1、YH-2组肝脏丙二醛（MDA）含量与对照组（YH-0）相比无显著差异（P＞0.05）；YH-2组的过氧化物酶（POD）活性略高于YH-0、YH-1组，但差异不显著（P＞0.05）；YH-0、YH-1和YH-2三组POD活性均显著高于YH-3组（P＜0.05）。

2.3 饲料中酵母水解物对大菱鲆幼鱼抗应激能力的影响（见表4）

表4 酵母水解物对大菱鲆幼鱼抗应激能力的影响

由表4可知，各试验组耐干旱时间和耐干旱存活率差异不显著（P＞0.05）；YH-3组的耐干旱时间大于YH-0组；YH-1、YH-2组的耐干旱存活率高于对照组，但无显著差异（P＞0.05）；YH-1组与YH-0组的耐低氧时间差异不显著（P＞0.05），YH-0、YH-1组耐低氧时间均显著高于YH-2、YH-3组（P＜0.05）；添加酵母水解物的各试验组的耐低氧存活率显著高于对照组（P＜0.05）；添加酵母水解物各试验组大菱鲆幼鱼的耐低盐时间显著高于对照组（P＜0.05），其中YH-2组耐低盐时间显著高于其他三组（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 饲料中酵母水解物对大菱鲆幼鱼免疫相关酶活性的影响

LZM是一种碱性蛋白，能水解细菌细胞壁中黏肽的乙酰氨基多糖并使之裂解被释放出来，形成一个水解酶体系，从而破坏和消除侵入体内的异物，实现机体防御功能[11]。王武刚对凡纳滨对虾的研究中，鱼粉替代量为15%时，血清LZM活性显著高于对照组，替代量大于15%后，各替代组血清LZM活性均低于对照组[3]。这与本研究结果一致，YH-2组LZM活性最高，添加量大于2%时其活性下降，说明适量的酵母水解物可提高大菱鲆幼鱼的LZM活性，而过高的添加量可能会有抑制作用。

AKP和ACP是两种重要的水解酶，对细菌等异物在溶酶体内的消化降解具有重要作用。在本研究中，YH-2组的AKP、ACP活性最高，随着饲料中酵母水解物含量进一步提高，其活性下降。NO是吞噬细胞发挥细胞毒作用的一种有效分子，一些非免疫细胞在激活时也能大量释放NO。NO的生物合成依赖于NOS[12]。本研究结果表明，酵母水解物可提高大菱鲆幼鱼肝脏NOS活性。

酵母水解物提高机体免疫能力，可能与其核苷酸、B族维生素等功能性物质含量丰富有关。Sajeevan曾指出核苷酸可作为水产动物的免疫增强剂[13]。王广军等研究表明，饲料中添加酵母核苷酸可提高凡纳滨对虾肌肉组织中LZM、ACP活性[14]。许丹丹等研究表明，饲料中添加核苷酸混合物可显著提高凡纳滨对虾肝胰腺碱性磷酸酶(AKP)活性[7]。周小秋指出，B族维生素可以通过提高血清LZM活性和血清ACP活性增强杀菌能力，通过增强血清总铁结合力提高抑菌能力，通过提高血清凝集素水平和血清补体含量促进白细胞吞噬作用，从而增强鱼体的非特异性免疫力[9]。刘立鹤等指出，酵母水解物粉状或膏状产品中都含有17%～30%的β-葡聚糖和甘露寡糖，这对于改善肠道微生态、增强水产动物的非特异性免疫能力具有重要的作用[15]。酵母水解物中含有酵母细胞壁多糖，能刺激免疫，促进免疫器官发育[16]。近年来的研究证实，β-葡聚糖能够提高溶菌酶的活性，提高免疫相关酶的活性，并能够活化B细胞和T细胞。

3.2 饲料中酵母水解物对大菱鲆幼鱼肝脏抗氧化能力的影响

T-AOC可以反映机体酶促和非酶促系统的抗氧化能力[17]。本研究中，YH-1组的T-AOC显著高于对照组（P＜0.05）。SOD可以消除体内多余的自由基，是机体清除氧自由基的重要抗氧化保护酶，它能促使自由基的形成和清除处于动态平衡，从而清除自由基对机体的危害，保护细胞免受损伤。当SOD活性降低时，其自由基等毒害物质就会积累[11]。丙二醛（MDA）是生物膜中的不饱和脂肪酸受到活性氧攻击，发生脂质过氧化的终产物，其含量可反映体内脂质过氧化强弱，间接反映组织细胞氧化损伤的程度。本研究中，YH-2组的SOD、POD活性高于其他组；YH-2组的MDA含量低于YH-0和YH-3组。综合上述指标，酵母水解物可以提高大菱鲆幼鱼肝脏抗氧化能力，且YH-2组大菱鲆幼鱼的肝脏抗氧化能力最强。这与王武刚对凡纳滨对虾的研究结果一致[3]。

酵母水解物提高大菱鲆幼鱼的抗氧化能力可能与其中含有丰富的B族维生素、核苷酸和小肽有关。有研究表明，随着硫胺素、核黄素、烟酸、泛酸、吡哆醇和肌醇添加量的提高，幼建鲤血清和肌肉MDA含量显著或极显著下降，血清、肝胰脏、肠道、后肾和肌肉等的一种或多种组织SOD活性显著或极显著提高[9]。许丹丹等研究表明，饲料中添加外源核苷酸可显著提高凡纳滨对虾肝胰脏的T-AOC活性(P＜0.05)，提高血清SOD活性(P＞0.05)[7]。苗新等研究表明，饲料中核苷酸添加量为300 mg/kg时，可显著提高大黄鱼血清SOD活性和T-AOC的活性，从而提高机体抗氧化能力[18]。王广军等研究显示，在饲料中添加酵母核苷酸可显著提高凡纳滨对虾肌肉组织中的SOD、POD活性[14]。姜柯君等对星斑川鲽的研究中，饲料中添加适量小肽后，肝脏和血清的SOD活性升高，MDA含量显著降低(P＜0.05)[19]。

3.3 饲料中酵母水解物对大菱鲆幼鱼抗应激能力的影响

应激反应是鱼体对各种环境因子的超常刺激所产生的一种非特异性生理反应。过度的应激不仅影响鱼类的生产性能，还会诱发多种疾病，甚至造成死亡[20]。本研究中，饲料中添加酵母水解物可提高大菱鲆幼鱼耐干旱及耐低氧应激的存活率，显著延长大菱鲆幼鱼耐低盐应激时间（P＜0.05）。由此可见，饲料中添加酵母水解物可提高大菱鲆幼鱼的抗应激能力。这可能与酵母水解物中丰富的核苷酸含量有关。Superchi等对仔猪的研究表明，在仔猪断奶前补充日粮核苷酸能提高断奶应激的适应能力[21]。王广军等研究表明，饲料中添加酵母核苷酸可提高凡纳滨对虾的抗应激能力[14]。

酵母水解物提高大菱鲆幼鱼的抗应激能力还可能与其中含有的酵母免疫多糖有关，酵母多糖可增加动物对外界不良刺激的适应性。研究显示，酵母细胞壁多糖可提高异育银鲫和草鱼的抗应激能力[20，22]。

4 结论

饲料中添加酵母水解物可提高大菱鲆幼鱼机体免疫能力、肝脏抗氧化性能和抗应激能力；且在本试验条件下，以添加2%的酵母水解物的效果最佳。