早幼粒细胞白血病蛋白的缺失对胃癌和结直肠癌预后的影响

林生力　陈艺樟　易拓　董天庚　洪信强　胡健卫　张震　牛伟新

(1. 复旦大学附属中山医院普外科， 上海　200032； 2. 第二军医大学卫生勤务学系， 上海　200433)

早幼粒细胞白血病蛋白的缺失对胃癌和结直肠癌预后的影响

林生力1△陈艺樟2△易拓1董天庚1洪信强1胡健卫1张震1牛伟新1

(1. 复旦大学附属中山医院普外科， 上海200032； 2. 第二军医大学卫生勤务学系， 上海200433)

摘要目的：研究早幼粒细胞白血病蛋白(promyelocytic leukemia protein，PML)与胃肠肿瘤的关系,并探讨PML与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)间的关系。方法： 采用免疫组化法检测胃癌和结直肠癌中PML、EGFR、VEGF的表达情况，并分析它们与肿瘤侵袭、淋巴结转移、TNM分期以及患者生存率之间的关系。结果： PML在胃肠癌旁正常组织中均呈阳性表达，其在胃癌组织中的缺失率为33.8%(54/160)，在肠癌组织中的缺失率为38.1%(64/168)。胃癌组织中PML缺失与肿瘤侵犯程度(P<0.001)、淋巴结转移(P=0.018)以及TNM分期(P<0.001)正相关；PML阳性患者较PML阴性患者生存期长(52个月 比 39个月，P<0.001)；年龄、PML表达与否以及TNM分期情况是影响胃癌预后的独立危险因素。结直肠癌组织中PML缺失与TNM分期(P=0.012)正相关，PML阳性患者较PML阴性患者生存期长(53个月 比 44个月，P=0.001)；结直肠癌组织中EGFR阳性表达与肿瘤组织侵犯程度(P<0.001)、淋巴结转移(P<0.001)以及TNM分期(P<0.001)正相关；PML是否缺失、TNM分期情况以及EGFR表达与否是影响结直肠癌患者预后的独立危险因素。PML表达与EGFR和 VEGF的表达负相关(P<0.05)。结论： PML缺失可能通过上调EGFR和VEGF的表达而促进胃癌和结直肠癌的进展；PML缺失与胃癌和结直肠癌患者的预后相关。

关键词早幼粒细胞白血病蛋白；胃癌；结直肠癌；表皮生长因子受体；血管内皮生长因子

中图分类号R 735.2

文献标识码A

Effect of Promyelocytic Leukemia Protein Deficiency on Prognosis of Gastric and Colorectal CancersLINShengli1△CHENYizhang2△YITuo1DONGTiangeng1HONGXinqiang1HUJianwei1ZHANGZhen1NIUWeixin1

1.DepartmentofGeneralSurgery,ZhongshanHospital，FudanUniversity,Shanghai200032,China； 2.FacultyofHealthService,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

AbstractObjective： To study the relation between promyelocytic leukemia protein (PML) and gastric and colorectal cancers, and explore the relation between PML and epidermal growth factor receptor (EGFR) and vascular endothelial growth factor (VEGF). Methods： The expression situations of PML, EGFR, and VEGF in gastric and colorectal cancer were detected by immunohistochemistry, and their relations with tumor invasions, lymph node metastases, TNM stages and patients’ survival were analyzed. Results： PML was positively expressed in normal tissue adjacent to gastrointestinal cancer. The rate of PML deficiency was 33.8%(54/160) in gastric cancer tissue, while it was 38.1%(64/168) in colorectal cancer tissue. PML deficiency in gastric cancer tissue was positively correlated with gastric wall invasion (P<0.001), lymph node metastases (P=0.018) and TNM stage (P<0.001), and the survival period of patients with positive PML was longer than that of patients with negative PML (52 months vs 39 months,P<0.001). Age, PML deficiency and TNM stage were the independent risk factors of gastric cancer prognosis. PML deficiency in colorectal cancer tissue was positively correlated with TNM stage (P=0.012), and the survival period of patients with positive PML was longer than that of patients with negative PML (53 months vs 44 months,P=0.001). The positive expression of EGFR was positively correlated with colorectal wall invasion (P<0.001), lymph node metastases (P<0.001) and TNM stage (P<0.001). PML deficiency, TNM stage and EGFR expression were the independent risk factors of colorectal cancer prognosis. PML expression was negatively correlated with EGFR and VEGF expression (P<0.05). Conclusions： PML deficiency may promote the progression of gastric and colorectal cancer by up-regulating the expression of EGFR and VEGF. PML deficiency is correlated with prognosis of gastric and colorectal cancer patients.

Key WordsPromyelocytic leukemia protein;Gastric cancer;Colorectal cancer;Epidermal growth factor receptor;Vascular endothelial growth factor

早幼粒细胞白血病蛋白(promyelocytic leukemia protein，PML)最初引起研究者注意是在急性早幼粒白血病患者中。位于第15号染色体上的 PML基因和位于第17号染色体上的维甲酸受体α(retinoic acid receptor α， RARα)基因发生不平衡异位，形成PML-RARα融合基因后表达PML-RARα蛋白，阻碍了PML和RARα的正常生理功能，从而诱发急性早幼粒细胞白血病。体内PML主要以PML核体(PML nuclear body, PML-NB)的形式存在于胞核及胞质，PML-NB与体内数十种蛋白有相互作用，包括Daxx、p53、Sp100、CREB(cAMP-responsive element-binding protein)以及泛素化修饰相关蛋白[1-3]。PML-NB如同细胞内的蛋白加工车间，负责加工修饰各种蛋白，从而影响细胞的分化生长等行为。

越来越多的证据表明，PML是肿瘤抑制因子，可以调控细胞的生长、衰老及凋亡。缺失PML基因的小鼠比正常小鼠更易罹患肿瘤[4]。目前一些关于PML与前列腺癌、肺癌、黑素瘤以及血液肿瘤干细胞关系的研究[5-6]证实，缺失PML的患者病情进展更迅速，预后更差。一般认为，PML位于信号转导通路上游，可以调控p53之类的分子，也可影响肿瘤中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的表达，可被泛素化修饰蛋白降解，但具体分子机制仍有待研究。目前，国内关于PML与肿瘤关系的研究多局限于血液系统肿瘤，在胃肠道肿瘤方面鲜有涉及。本研究采用免疫组化法检测PML在中国胃癌和结直肠癌患者的癌组织及癌旁正常组织中的表达情况，以明确PML与胃肠肿瘤的关系并探讨可能的分子机制。

1资料与方法

1.1一般资料选择2008—2010年在复旦大学附属中山医院就诊的160例胃癌患者以及168例结直肠癌患者。胃癌组男性106例，女性54例，平均年龄61.32岁。结直肠癌组男性88例，女性80例，平均年龄69.01岁。两组患者均由同一胃肠专科手术组的医师进行胃癌或结直肠癌根治手术治疗；术前均未行放化疗；术后胃癌组肿瘤累及固有肌层或淋巴结有转移者接受化疗，结直肠癌组肿瘤累及肌层或淋巴结有转移者接受化疗，直肠癌患者增加放疗。

1.2方法标本取样：胃癌患者癌组织取自胃癌组织边缘与正常胃黏膜组织交界处；胃癌患者正常组织取自距胃癌组织边缘5 cm以上的正常胃黏膜组织。结直肠癌患者癌组织取自肠癌组织边缘与正常肠道黏膜组织交界处；结直肠癌患者正常组织取自距肠癌组织边缘10 cm以上的正常肠道黏膜组织。

用EnVision法进行PML免疫组化染色：PML一抗为1∶100稀释的兔抗人PML ab53773抗体(英国Abcam公司)，二抗为抗兔/鼠通用型免疫组化试剂盒REALTMEnVision+/HRP RABBIT/MOUSE(丹麦Dako Denmark A/S公司)。采用二级计分法，根据阳性细胞所占比例(观察5个以上高倍镜视野)计分， 0%～5%为0分， 5%～25%为1分； 25%～50%为2分； 50%～75%为3分；>75%为4分。染色强度计分：无着色为0分；淡黄色为1分；黄或深黄色为2分；褐或棕褐色为3分。定义阳性细胞比例计分乘以染色强度计分大于1者为阳性结果。

EGFR(胃癌中为HER-2)和血管内皮生长因子的免疫组化染色由复旦大学附属中山医院病理科负责，方法均为DAB显色法：EGFR一抗为罗氏4B5(瑞士罗氏制药有限公司)，二抗为罗氏Ventana专用HRP试剂盒(瑞士罗氏制药有限公司)；VEGF一抗为Abcam VG-1(英国Abcam公司)，二抗为Leica Bond DS9800试剂盒(美国Leica Biosystems公司)。

1.3统计学处理建立病例统计量化表格及数据库，采用SPSS 13.0软件进行分析，所有检验和P值均为双侧。免疫组化染色阳性率的比较采用χ2检验；单因素生存分析采用Kaplan-Meier分析，多因素生存分析采用Cox多元回归法。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1PML的表达情况免疫组织化学染色结果显示，对于160例胃癌患者，PML在癌旁正常组织中均呈阳性表达(图1)，在癌组织中有54例表达缺失，缺失率33.8%(图2)；对于168例结直肠癌患者，PML在癌旁正常组织中均呈阳性表达(图3)，在癌组织中有64例表达缺失，缺失率38.1%(图4)。

2.2PML与胃癌、结直肠癌患者的临床病理特征的关系胃癌患者中，PML的缺失与肿瘤组织侵犯程度(P<0.001)、淋巴结转移(P=0.018)以及TNM分期(P<0.001)正相关，而与性别、年龄等无相关，见表1。结直肠癌患者中，PML的缺失与TNM分期(P=0.012)正相关，而与性别、年龄、肿瘤组织侵犯程度和淋巴结转移无相关，见表2。

A：×50，B：×100，C：×200，D：×400

图1PML在癌旁正常胃组织中的表达情况

A、B为PML阳性；C、D为EGFR(HER-2)阳性；E、F为VEGF阳性。其中A、C、E为×100视野，B、D、F为×200视野

图2胃癌组织中PML、EGFR(HER-2)、VEGF的表达情况

A：×50，B：×100，C：×200，D：×400

图3PML在癌旁正常肠组织中的表达情况

2.3PML与胃癌和结直肠癌患者预后的关系胃癌患者中，PML阴性者的平均生存时间为 39.122 个月，PML阳性者的平均生存时间为 52.068 个月，差异有统计学意义(P<0.05)，见图5。结直肠癌患者中，PML阴性者平均生存时间为44.292个月，PML阳性者平均生存时间为53.482个月，差异有统计学意义(P<0.05)，见图6。

2.4胃肠肿瘤组织中EGFR和VEGF的表达与临床特征的关系为了进一步了解PML在胃肠肿瘤中的作用机制，我们检测了EGFR(胃癌病例中为HER2)和VEGF在胃肠肿瘤组织中的表达情况，见图2、图4。

胃癌患者中EGFR和VEGF的表达与性别、年龄、肿瘤侵犯程度、淋巴结转移、TNM分期无相关性(表1)。结直肠癌患者中EGFR阳性表达与肿瘤组织侵犯程度(P<0.001)、淋巴结转移(P<0.001)以及TNM分期(P<0.001)正相关(P<0.05)，而与性别、年龄无相关性；结直肠癌患者中，VEGF阳性表达与性别、年龄、肿瘤侵犯程度、淋巴结转移、TNM分期均无相关性(表2)。

A、B为PML阳性；C、D为EGFR阳性；E、F为VEGF阳性。其中A、C、E为×100视野，B、D、F为×200视野

2.5PML与EGFR、VEGF表达的负调控关系胃癌、结直肠癌患者中，PML的表达与EGFR、VEGF的表达均负相关(P<0.05)，见表3～4。

2.6胃癌、结直肠癌患者预后的多因素分析胃癌患者中，年龄、肿瘤组织中PML表达与否以及TNM分期情况是影响预后的独立因素(表5)；结直肠癌患者中，患者肿瘤组织中PML表达与否、TNM分期情况以及EGFR表达情况是影响预后的独立因素(表6)。

3讨论

鉴于胃癌和结直肠癌的生物学特性及临床病理特征的差异，本研究中对胃癌和结直肠癌分别进行了分析。本研究证实PML是肿瘤抑制因子，在胃癌和结直肠癌患者的正常组织中PML均呈阳性表达，而在胃癌和结直肠癌组织中有1/3的标本中PML表达缺失， PML表达缺失的患者的TNM分期及预后相对较差。

一般而言，胃癌和结直肠癌的预后与T分期、N分期相关。虽然本研究中胃肠肿瘤患者的预后与TNM分期相关，但T分期、N分期并不是预后的独立影响因子。这可能与本研究的样本量较少有关，还可能与T分期、N分期高的胃肠肿瘤患者通常在术后进行化疗有关；此外，本研究以T1/2、T3/4，N0、Nx划分T分期和N分期可能过于笼统导致统计上未能体现出T分期、N分期的临床意义。这些问题有待在后续的研究设计中改进。

PML发挥对肿瘤的抑制作用时位于信号通路上游，通过影响下游某些信号分子的表达而直接改变细胞的分化增殖能力[7]。通常认为，EGFR和VEGF可以促进肿瘤的发生发展。Kuo等[8]的研究证实，在肺癌发生发展过程中，PML通过抑制EGFR的表达而起到抑制肿瘤的作用；而Bernardi等[9]的研究则显示，乏氧微环境中PML通过抑制mTOR-HIF1α-VEGF信号通路而阻碍了肿瘤的进展。受此启发，本研究同时检测了胃肠肿瘤中EGFR(胃癌中为HER-2)和VEGF的表达，并分析了它们与PML表达的相关性，结果显示，PML与EGFR、VEGF的表达均负相关。因PML居于信号调控上游，故推测PML是EGFR和VEGF的负调控因子。另一方面，也可认为胃肠肿瘤中PML的缺失激活了EGFR和VEGF的表达，从而促进了肿瘤的发生发展，这或许是本研究中胃癌和结直肠癌患者中PML缺失者的分期及预后相对较差的原因。然而，多因素分析发现，PML是胃癌和结直肠癌患者预后的独立影响因素，而EGFR仅在结直肠癌患者中是预后的独立影响因素。因此，不能简单地认为，在缺失PML的胃癌、结直肠癌患者中，由于体内EGFR或VEGF的表达上调而促进肿瘤进展并影响预后。PML失活对肿瘤进展的促进作用不能完全通过EGFR或VEGF相关信号通路解释，可能有其他信号通路参与调控。

综上所述，在胃癌、结直肠癌患者中，PML与EGFR和VEGF有负调控关系。PML缺失影响胃肠肿瘤发生发展的具体分子机制尚待进一步研究，EGFR和VEGF相关信号通路可能只是错综复杂的信号调控网络中的一环。

参考文献

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[9]Bernardi R, Papa A, Egia A, et al. Pml represses tumour progression through inhibition of mTOR[J]. EMBO Mol Med,2011,3(5):249-257.