细胞内Zn内流减少在低氧保护髓核细胞中的作用及其机制

殷潇凡　徐俊　谷辉杰　吴旭华　刘建兴　陈炯　宗阳铭

(上海市闵行区中心医院，上海　201199)

·论著·

细胞内Zn内流减少在低氧保护髓核细胞中的作用及其机制

殷潇凡徐俊谷辉杰吴旭华刘建兴陈炯宗阳铭

(上海市闵行区中心医院，上海201199)

摘要目的：探讨细胞内Zn2+的浓度在低氧调节髓核细胞表达金属蛋白酶(metalloproteinases, MMPs)和细胞外基质(ECM)中的作用及其机制。方法： 从SD大鼠中提取髓核细胞后首先进行平面培养，然后用藻酸钠凝胶进行三维培养。采用FluoZin-3 AM染色法检测细胞内Zn2+的浓度(intracellular Zn2+concentration， [Zn2+]i)；采用阿利新蓝染色分析细胞分泌蛋白多糖的含量，采用二甲基亚甲蓝分光光度法(DMMB)检测糖胺聚糖的表达水平，采用real-time PCR分析II型胶原(α1 type II collagen，COL2A1)、金属蛋白酶13 (matrix metalloproteinase 13，MMP-13)和解整合素样金属蛋白酶5(a disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin motif 5，ADAMTS-5)mRNA的表达。通过免疫组化法和Western印迹法分析锌铁转运蛋白8(ZRT,IRT-like protein 8,ZIP8)的表达水平。结果： IL-1β和ZnCl2可以显著提高髓核细胞内的[Zn2+]i，但是该作用可以被低氧所抑制。在藻酸钠三维培养的髓核细胞中，低氧可以显著改善IL-1β和ZnCl2引起的蛋白多糖、糖胺聚糖和COL2A1 mRNA的降低，但ZnCl2可以抑制低氧的保护作用。细胞内Zn2+的螯合剂和低氧可以抑制MMP-13 mRNA水平的升高。IL-1β和ZnCl2促进髓核细胞中ZIP8的表达升高，但是低氧可抑制ZIP8的表达。结论： 低氧可以调节髓核细胞中Zn2+的内流，Zn2+介导了低氧对髓核细胞中MMP-13和ECM的调节作用。[Zn2+]i的变化可能参与了椎间盘退变的过程。

关键词锌；低氧；髓核细胞；代谢

中图分类号R681.5

文献标识码A

Effect and Mechanism of Decreasing Intracellular Zn2+Influx in the Hypoxia Protection of Nucleus Pulposus CellsYINXiaofanXUJunGUHuijieWUXuhuaLIUJianxingCHENJiongZONGYangming

CentralHospitalofMinghangDistrict,Shanghai201199,China

AbstractObjective： To explore the effect and mechanism of intracellular Zn2+concentration ([Zn2+]i) in hypoxia-induced regulation of metalloproteinases (MMPs) and extracellular matrix (ECM) expression in nucleus pulposus (NP) cells. Methods： NP cells from SD rats received plate culture at first and then three-dimensional culture with sodium alginate gel. [Zn2+]i was assayed by FluoZin-3 AM staining. Proteoglycan was assayed by Alcian blue staining. Glycosaminoglycan was detected by 1,9-dimethylmethylene blue (DMMB) assay. And real-time PCR were used to assay the mRNA expression of α1 type II collagen (COL2A1), matrix metalloproteinase 13 (MMP-13) and a disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin motif 5 (ADAMTS-5). The expression of ZRT,IRT-like protein 8(ZIP8) was assayed by immunohistochemistry and Western blotting. Results： Interleukin (IL)-1β and ZnCl2could significantly increase the [Zn2+]i of NP cells, however, the effect could be inhibited by hypoxia. Hypoxia did significantly attenuate the decrease of proteoglycan, glycosaminoglycan, and COL2A1 mRNA, which was induced by IL-1β and ZnCl2treatment, in sodium alginate three-dimensional culture. However, ZnCl2inhibited the protective effect of hypoxia. Both an intracellular Zn2+chelator and hypoxia could inhibit the increase of MMP-13 mRNA expression. IL-1β and ZnCl2treatment promoted the increase of ZIP8 expression in NP cells, however, hypoxia inhibited ZIP8 expression. Conclusions： Hypoxia may regulate the Zn2+influx in NP cells. Zn2+mediates the regulation effect of hypoxia on ECM and MMP-13. Perhaps the changes of [Zn2+]i are involved in the process of intervertebral disc degeneration.

Key WordsZinc;Hypoxia;Nucleus pulposus cells;Metabolism

有关椎间盘退变的发生发展机制，目前尚不明确[1-2]。许多潜在致病因素均可引起椎间盘中代谢平衡失调，导致细胞外基质(extracellular matrix，ECM)降解。椎间盘中主要的ECM包括Ⅱ型胶原和蛋白多糖，而金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和解整合素样金属蛋白酶(disintegrins and metalloproteinases with thrombospondin motifs，ADAMTSs)是降解ECM的主要蛋白酶[3]。MMP-1、 MMP-2、 MMP-3、 MMP-7、 MMP-8、 MMP-10和MMP-13以及ADAMTS-1、ADAMTS-4和ADAMTS-5在退变椎间盘中的表达水平高于正常椎间盘。在本研究中，我们主要分析MMP-13和ADAMTS-5。

哺乳动物的MMPs包含1个保守结构，这个结构包括自我抑制的前结构域和1个催化结构域[4]。其中，催化结构域包含1个催化的Zn2+、1个结构性的Zn2+和3个典型的Ca2+；前结构域包含1个保守的半胱氨酸的开关结构[5]。当MMPs失活的时候，Zn2+的活性区域会被结合从而抑制半胱氨酸的活性；当MMPs激活的时候，Zn2+与半胱氨酸的交互作用则被打乱[5]。因此，Zn2+在MMPs介导的基质降解过程中十分重要。近来发现，Zn2+与骨关节炎患者中MMPs介导的细胞外基质的降解过程密切相关[6]。然而，对于Zn2+在椎间盘细胞代谢中的作用，目前尚知之甚少。

低氧是椎间盘代谢的重要特点。由于椎间盘缺乏血液供应，椎间盘髓核中氧分压仅0.5 kPa，髓核细胞处于乏氧的状态。但是，低氧对髓核细胞有一定的保护作用，低氧可以提高髓核细胞中蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达水平。有研究[7]发现，低氧可以减少胰腺β细胞中Zn2+的内流。但是，在髓核细胞中低氧与Zn2+的关系尚不明确，本文旨在对此作一探讨。

1资料与方法

1.1实验试剂与耗材3周大小250 g左右的SD大鼠购自复旦大学动物科学部。钙离子荧光探针FluoZin-3 AM购买自美国Invitrogen生命技术公司，ZIP8一抗购自美国Proteintech公司，白细胞介素-1β(IL-1β)、Pluronic F-127、锌离子螯合剂TPEN[N,N,N′,N′-tetrakis (2-pyridylmethyl) ethylenediamine]、DMB(1,9-dimethylmethylene blue),硫酸软骨素(chondroitin sulfate)和阿利新蓝染液购自美国Sigma公司。所有有关细胞培养的试剂均购自美国 Gibco 公司。

1.2实验方法

1.2.1髓核细胞的培养参考已经发表的文献[8]，在显微镜下将胶冻样的髓核组织从大鼠的腰椎间盘中取出并在0.1%的Ⅱ型胶原酶中消化4 h，然后经70 μm的滤器过滤。用高糖的含有10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素和链霉素的DMEM培养基培养髓核细胞。平面培养两代后，将髓核细胞消化后进行三维培养。

1.2.2藻酸钠三维培养为了避免髓核细胞的去分化，将髓核细胞培养在藻酸钠凝胶中。将1×106/mL的细胞重悬在1.2%的低黏度的藻酸钠氯化钠溶液中(藻酸钠溶于150 mmol/L的氯化钠溶液中)。用22G的注射器将上述细胞悬液逐滴滴加在200 mmol/L的CaCl2溶液中。30 min后，藻酸钠发生聚化，形成球形的小珠子，然后用150 mmol/L的氯化钠溶液和DMEM清洗，清洗后在24孔板中培养。

当需要将髓核细胞从凝胶中释放出来进行实验时，将凝胶在2.2%的枸橼酸钠溶液中37℃孵育10 min，然后用0.1%的Ⅱ型胶原酶消化5 min并离心，即可得到细胞团。

1.2.3实验设计为了达到低氧状态,将水凝胶中的髓核细胞培养在三气培养箱,充氮气以维持1%O2的低氧状态。用100 μmol/L ZnCl2和(或)10 ng/mL IL-1β处理髓核细胞24 h。用TPEN螯合游离的Zn2+时，在加ZnCl2和IL-1β前2 h加入TPEN。

1.2.4细胞内Zn2+水平的测量采用FluoZin-3 AM染色法测定细胞内的锌离子浓度(intracellular Zn2+concentration， [Zn2+]i)。在玻璃培养皿上培养的髓核细胞加2 μmol/L FluoZin-3和0.1% Pluronic F-127后，在37℃中孵育37 min，进行Zn2+的加载。然后用D-Hanks清洗细胞后再孵育20 min。使用倒置的共聚焦显微镜在激发波长为490 nm和发射波长为530 mm的条件下观察髓核细胞中的荧光强度。为了进行半定量分析，将髓核细胞培养在24孔板中，经上述处理后用多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司；型号：Flex Station3)采集各组的荧光强度。

1.2.5组织学检测藻酸钠水凝胶珠子用4%的多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋后切成4 μm厚的切片。将阿利新蓝8GX溶解在冰醋酸中，配成1%溶液。室温下用此溶液孵育凝胶切片30 min。用 0.1%的核固红反染20 s后进行梯度脱水。然后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3遍后在光学显微镜下观察。同时，对切片进行HE (hematoxylin-eosin)染色和甲苯胺蓝染色。

1.2.6免疫组化和细胞免疫荧光采用免疫组化法或者免疫荧光法观察大鼠的椎间盘、平面培养的细胞和三维培养的髓核细胞中ZIP-8的表达水平。取大鼠尾椎Co6～7，在10%甲醛中固定2 d，然后在10%乙二胺四乙酸 (ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)中脱钙1个月。将椎间盘切片后与藻酸钠凝胶切片一同进行脱蜡和脱水，用3%双氧水孵育20 min，在柠檬酸钠缓冲液中加热进行抗原修复。用含0.1%Triton X-100的5%牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)封闭1 h后，将细胞及切片加ZIP8一抗(1∶200)后4℃孵育过夜。最后，切片加辣根过氧化物酶标记的二抗后常温下孵育2 h，并用苏木素反染；而细胞则加入由异硫氰酸荧光素(FITC)标记的二抗后暗室中孵育2 h，并用二脒基苯基吲哚(DAPI)染核。细胞和切片在分别使用倒置荧光显微镜和正置显微镜进行观察(日本Olympus公司)。

1.2.7糖胺聚糖产量的检测采用二甲基亚甲蓝分光光度法(DMMB法) 分析培养基中糖胺聚糖(glycosaminoglycan， GAG)的产量。实验设计中的处理完成后，收集培养基并使用离心滤器(美国Millipore公司；型号：Centricon YM-50)以5300 r/min速度离心30 min。

1.2.8Western印迹提取细胞的总蛋白时，将含有1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)的RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液加入到三维培养后从藻酸钠凝胶中提取的髓核细胞中，采用二喹啉甲酸(BCA)法分析总蛋白的浓度。配置好SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)胶后，将总蛋白上样，上样量为50 mg。电泳后，湿转至PVDF(polyvinylidene difluoride)膜。用5%的脱脂奶粉封闭2 h，然后加ZIP8和β-actin (1∶1000)的一抗4℃孵育过夜。用TBST(Tris-buffered saline with Tween)洗膜3次后，用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗在常温下孵育2 h，清洗后用增强化学发光曝光仪(美国PerkinElmer公司)进行观察。采用AlphaEaseFC 4.0 software对条带进行半定量分析。

1.2.9Real-time PCR采用TRIzol法提取总RNA并测量浓度，用逆转录试剂盒(立陶宛 MBI Fermantas 公司)将1 μg RNA逆转录为cDNA。应用Mastercycler○Rep realplex(德国Eppendorf公司)荧光定量PCR仪进行PCR，PCR引物如表1所示。20 μL的PCR反应混合物包括2 μL的2倍稀释的cDNA, 10 μL SYBR PremixEx Taq Ⅱ, 0.2 μL引物，用去离子水补足。反应程序为50℃ 2 min；95℃ 30 s； 95℃ 5 s， 40个循环； 60℃ 34 s。获取Ct(cycle threshold)后，用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因进行校正。mRNA的相对水平采用2-ΔΔCt法进行计算。

1.3统计学处理采用Graphpad Prism5 和SPSS 19 软件进行统计学分析。多组之间参数的比较采用方差分析；如果有统计学意义，采用Tukey’s test进行两两之间的比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1低氧降低髓核细胞中Zn2+的浓度在20%的常氧环境下，ZnCl2和IL-1β 可显著提高髓核细胞中的[Zn2+]i(P<0.05)，见图 1A、 1B。采用同样的ZnCl2和IL-1β处理条件，在1%低氧环境下髓核细胞中的[Zn2+]i明显小于常氧环境时(P<0.05)，提示低氧可以抑制髓核细胞中的Zn2+水平。在低氧环境中，ZnCl2和IL-1β协同作用下髓核细胞中的[Zn2+]i明显大于ZnCl2和IL-1β单独作用时的水平。

A：荧光显微镜下髓核细胞中的[Zn2+]i；B：A图的半定量分析,*P<0.05,**P<0.01

图1髓核细胞中的[Zn2+]i

2.2[Zn2+]i的变化参与低氧引起的三维培养髓核细胞中ECM的改变如图2A～D所示，培养在直径为2～4 mm的珠子状的凝胶中，髓核细胞仍然维持着类软骨的特性(图2E～H)。阿利新蓝染色结果显示，与常氧相比较，低氧可以提高髓核细胞中蛋白多糖的产量(图2I)。更重要的是， 低氧条件下ZnCl2处理后的髓核细胞中的蛋白多糖明显多于常氧条件下同样处理的髓核细胞，提示低氧可以缓解ZnCl2引起的ECM的降解。

采用DMMB和real-time PCR分析糖胺聚糖(GAG)和Ⅱ型胶原(α1 type Ⅱ collagen，COL2A1) mRNA的变化。相对常氧环境，低氧能显著提高经ZnCl2和IL-1β处理后的髓核细胞中的GAG和COL2A1 mRNA的表达(图2J、 2K,P<0.05)。低氧可以提高经IL-1β处理的髓核细胞中的GAG和COL2A1 mRNA的表达，但这种作用可以被ZnCl2所抑制，这提示ZnCl2引起的Zn2+内流甚至可以逆转低氧对髓核细胞的保护作用。

A～H：髓核细胞的藻酸钠三维培养；I：髓核细胞的阿利新蓝染色；J：髓核细胞中糖胺聚糖产量的检测；K：髓核细胞中COL2A1的mRNA的表达；*P<0.05,**P<0.01

图2三维培养的髓核细胞的大体图片、阿利新蓝染色、DMMB分析以及COL2A1 mRNA的表达

2.3[Zn2+]i的变化参与低氧引起的三维培养髓核细胞中MMPs的改变由于MMPs和ADAMTSs是降解髓核ECM的主要蛋白酶，因此，我们也分析了[Zn2+]i对它们的作用。相对于常氧，低氧抑制了IL-1β引起的MMP-13和ADAMTS-5 mRNA水平的升高， 但该作用会被IL-1β 和ZnCl2协同作用逆转(图3A,P<0.05)。TPEN是一种膜通透性的Zn2+的螯合剂。与低氧的作用相似，TPEN也可以显著抑制ZnCl2引起的髓核细胞中MMP-13 mRNA表达的升高(图3B，P<0.05)。然而，较为奇怪的是，Zn2+内流的单独作用并不能调节ADAMTS-5的表达。

2.4ZIP8的表达及在低氧和IL-1β作用下的变化由于ZIP8介导了软骨细胞中Zn2+的内流，因此，我们就其在髓核细胞中的表达水平进行了研究。免疫组化和免疫荧光显示，在髓核组织和培养的髓核细胞中，细胞膜和细胞浆中均有ZIP8表达(图4A～F)。ZnCl2提高了藻酸钠凝胶中的髓核细胞中ZIP8的表达(图4G)。IL-1β使髓核细胞中ZIP8表达增加，且有剂量依赖作用(图4G)。不论IL-1β处理与否，低氧均可抑制ZIP8的表达，体现了ZIP8在低氧抑制[Zn2+]i中的作用(4H、I)。

A～F：髓核组织中、平面培养以及三维培养的髓核细胞中ZIP8的表达；G：IL-1β作用下髓核细胞中ZIP8的表达；H：IL-1β以及低氧下髓核细胞中ZIP8的表达；I：H中相对量的分析。*P<0.05,**P<0.01

图4ZIP8在髓核组织和髓核细胞中的表达以及低氧和IL-1β对ZIP8表达的影响

3讨论

与机体中的其他细胞不同，髓核细胞更倾向于生活在低氧的环境中；在低氧环境中髓核细胞的活性和ECM的代谢平衡更加稳定[9]。虽然通常认为缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)和缺氧诱导因子2α(hypoxia-inducible factor 2α，HIF-2α)介导了低氧的作用，但仍有研究者持不同见解[10]；而且有关HIF对ECM的确切作用目前仍然未知，可能有其他的介质介导了低氧的作用。本研究证明，细胞内Zn2+的水平变化可能是低氧调节ECM的重要因素。

在正常生理状况下，Zn2+的平衡与骨骼生长、胚胎发育以及神经和免疫系统密切相关[11-12]。在骨关节中，Zn2+与软骨细胞的凋亡和ECM的重塑相关[6, 13]。在髓核细胞中，我们发现Zn2+的内流可以引起MMPs的升高和ECM的降解，这提示细胞内Zn2+的变化可能参与椎间盘的退变。我们还发现，ZnCl2和 IL-1β可引起[Zn2+]i 和ZIP8表达的升高。由于IL-1β是公认的引起椎间盘分解代谢的因子，因此，Zn2+的内流可能介导了IL-1β对椎间盘的作用，而ZIP8可能介导了IL-1β引起的Zn2+的内流。

细胞内游离的Zn2+主要由多种Zn2+转运体进行调节，其中ZIP14 (SLC39A14) 和ZIP13 (SLC39A13)调节生长板中细胞Zn2+的内流，而ZIP8则参与软骨细胞中Zn2+的内流[11, 14]。本研究发现，低氧可以抑制ZIP8的表达。因此，我们推测低氧可能通过抑制ZIP8蛋白的表达来抑制Zn2+的内流，有待后续研究进一步证实。

由于Zn2+是MMPs的重要组成成分，故细胞内Zn2+水平的改变可以调节MMP-13和ECM，这也符合逻辑。但是，我们发现，ZnCl2单独处理髓核细胞并不足以引起细胞中ADAMTS-5表达的增加，这与之前报道的结果相一致[6]。然而，ZnCl2和IL-1β的协同作用可以引起ADAMTS-5的改变，这说明Zn2+对ADAMTS-5的作用小于对MMP-13的作用。

在平面培养的条件下，髓核细胞容易出现去分化的现象，伴随着Ⅱ型胶原和蛋白多糖等细胞表型的表达降低；而用藻酸钠凝胶进行的三维培养可以显著抑制髓核细胞的去分化[15]。

综上所述，低氧抑制髓核细胞中Zn2+的内流，这可能介导了MMP合成的减少和ECM的降解。Zn2+转运体ZIP8也由低氧进行调节，因此，ZIP8可能介导了低氧状态Zn2+内流的抑制。这些结果说明，细胞内Zn2+水平的变化可能是将来防治椎间盘退变的一个潜在的靶点。

参考文献

[1]Sakai D, Grad S. Advancing the cellular and molecular therapy for intervertebral disc disease[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2015, 84:159-171.

[2]Fontana G, See E, Pandit A. Current trends in biologics delivery to restore intervertebral disc anabolism[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2015, 84:146-158.

[3]Vo NV, Hartman RA, Yurube T, et al. Expression and regulation of metalloproteinases and their inhibitors in intervertebral disc aging and degeneration[J]. Spine J, 2013,13(3): 331-341.

[4]Page-McCaw A, Ewald AJ, Werb Z. Matrix metallo-proteinases and the regulation of tissue remodelling[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007,8(3): 221-233.

[5]Visse R, Nagase H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry[J]. Circ Res, 2003,92(8): 827-839.

[6]Kim JH, Jeon J, Shin M, et al. Regulation of the catabolic cascade in osteoarthritis by the zinc-ZIP8-MTF1 axis[J]. Cell, 2014,156(4): 730-743.

[7]Gerber PA, Bellomo EA, Hodson DJ, et al. Hypoxia lowers SLC30A8/ZnT8 expression and free cytosolic Zn2+in pancreatic beta cells[J]. Diabetologia, 2014,57(8): 1635-1644.

[8]江立波, 张小磊, 徐华梓, 等. 细胞自噬对饥饿环境下椎间盘髓核细胞的保护作用[J]. 中国病理生理杂志, 2012,28(7): 1302.

[9]Chen JW, Li B, Yang YH, et al. Significance of hypoxia in the physiological function of intervertebral disc cells[J]. Crit Rev Eukaryot Gene Expr, 2014,24(3): 193-204.

[10]Gogate SS, Nasser R, Shapiro IM, et al. Hypoxic regulation of beta-1,3-glucuronyltransferase 1 expression in nucleus pulposus cells of the rat intervertebral disc: role of hypoxia-inducible factor proteins[J]. Arthritis Rheum, 2011,63(7): 1950-1960.

[11]Fukada T, Hojyo S, Furuichi T. Zinc signal: a new player in osteobiology[J]. J Bone Miner Metab, 2013,31(2): 129-135.

[12]Fukada T, Yamasaki S, Nishida K, et al. Zinc homeostasis and signaling in health and diseases: Zinc signaling[J]. J Biol Inorg Chem, 2011,16(7): 1123-1134.

[13]Sauer GR, Smith DM, Cahalane M, et al. Intracellular zinc fluxes associated with apoptosis in growth plate chondrocytes[J]. J Cell Biochem, 2003,88(5): 954-969.

[14]Hojyo S, Fukada T, Shimoda S, et al. The zinc transporter SLC39A14/ZIP14 controls G-protein coupled receptor-mediated signaling required for systemic growth[J]. PLoS One, 2011,6(3): e18059.

[15]Rastogi A, Thakore P, Leung A, et al. Environmental regulation of notochordal gene expression in nucleus pulposus cells[J]. J Cell Physiol, 2009,220(3): 698-705.

通讯作者宗阳铭，E-mail：18918169029@189.cn