构建生物心脏起搏器的种子细胞的研究进展

姬瑞娟 综述 杨向群 审校

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构建生物心脏起搏器的种子细胞的研究进展

姬瑞娟 综述 杨向群 审校

随着基因工程、干细胞、组织工程、再生医学等领域的深入研究，使用细胞移植、组织工程方法构建生物心脏起搏器有望成为今后的发展方向。这些方法的基础和关键是找到理想的种子细胞。目前，用于构建生物心脏起搏器的种子细胞有成体细胞和干细胞。本文就构建生物心脏起搏器的种子细胞的研究进展进行综述。

生物心脏起搏器 成体细胞 干细胞

所谓生物心脏起搏器，是指运用生物学原理和相关技术，利用具有起搏功能的细胞或组织来替代病损的起搏或传导组织，以达到重建、恢复心脏起搏和传导功能的目的[1]。随着基因工程、干细胞、组织工程、再生医学等领域的蓬勃发展，生物心脏起搏器有望能克服电子起搏器的不足，如：①起搏频率不能随患者的生理状态的变化而变化；②使用年限；③易受磁场干扰；④更换电池所致的再次手术损伤等。

构建生物起搏器的方法包括基因转染[2]、细胞移植[3]和组织工程[4]等。其中，使用细胞移植、组织工程方法构建生物心脏起搏器可能是今后的重要发展方向，其基础和关键是找到理想的种子细胞。目前，用于构建生物心脏起搏器的种子细胞有①成体细胞：窦房结细胞、幼稚心脏细胞及经基因修饰的心肌工作细胞等；②干细胞：包括胚胎干细胞（ES）、诱导性多能干细胞（iPS）和骨髓间充质干细胞（BMSCs）等。

1 成体细胞

窦房结是正常心脏的起搏点，其主要工作细胞就是窦房结细胞（P细胞）。将异体正常窦房结细胞移植到受体心脏，替代功能障碍的原有节律点，可重新启动心脏的泵血活动。Ruhparwar等[5]首次将急性分离的胎犬心房肌细胞（含窦房结细胞）移植到成年犬的左室前壁，移植细胞可存活，并与宿主心肌细胞形成缝隙连接。利用射频消融损毁房室结后，可检测到来源于细胞移植部位的室性逸搏心律。Lin等[6]将胎儿心房肌细胞（窦房结细胞）移植到猪的左心室游离壁。结果显示，移植细胞能存活，供体心肌和宿主细胞间connexin-43和N-cadherin表达阳性，3周后射频消融房室结，心室跳动的频率加快，并且起搏功能可受药物调节。电生理研究发现，心室节律来源于细胞注射区域。Cai等[7]用新生猪的心房肌细胞（含窦房结细胞）重复了上述研究，得出了同样的结论。张浩等[8-10]利用动物自体组织细胞进行了移植研究，分别取未成年猪窦房结细胞、成年犬窦房结细胞和心耳肌细胞，自体移植到右室前壁和右室近心尖部。在造成完全性房室传导阻滞后，发现移植组心室率高于对照组，且心律均起源于细胞移植部位，对异丙肾上腺素的调节敏感，移植细胞之间以及移植细胞与心肌细胞之间形成了缝隙连接。Zhang等[11]后来又提出移植细胞构建生物起搏器，需要考虑移植部位的环境对生物起搏器的影响。

但这类组织细胞移植的缺点是：①供体来源困难，特别是自体细胞；②异体细胞存在排异问题；③成熟的P细胞对移植部位的微环境适应性差。因此，未来临床应用的前景尚不明确，但这些研究为构建生物起搏器提供了可行性依据。

2 干细胞

干细胞具有很强的自我更新和多向分化能力，可分为胚胎来源干细胞、成体干细胞及诱导性干细胞三类。

2.1 胚胎来源干细胞

目前运用于生物心脏起搏器研究的胚胎来源干细胞主要为胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESCs）和胚胎心脏祖细胞。前者源自内细胞团，可分化为3个胚层的任何细胞。Kehat等[12]成功地在体外将人ESCs诱导分化为心肌样细胞，其中8.1%的细胞出现自发性搏动。将诱导后的hESCs移植至猪心室壁，能成功起搏完全性房室传导阻滞的心室。Xue等[13]报道，基因修饰后的hESCs来源的心肌细胞，可在体外使静止的心室肌细胞产生节律性的电-收缩活动，将细胞移植至豚鼠心室肌，发现电活动从注射部位向周围心肌传播，最后起搏心室肌。

上述ESCs来源的心肌细胞一般是从类胚体中跳动区域分离得到的，这些早期的心肌细胞具有起搏细胞的特性，可作为构建生物起搏器的种子细胞，但这些细胞的数量少、纯度不理想。为了能够从ESCs中分离获得更多、更纯的起搏细胞，大量研究聚焦于Pitx2c、Shox2、Tbx、HCN等。Guddati等[14]首次将胚胎心肌发育相关的转录因子Pitx2c过表达于ESCs，获得了心肌样细胞，可作为生物心脏起搏器的种子细胞。Ionta等[15]直接将与起搏细胞发育相关的转录因子Shox2基因转染至小鼠ESCs，获得了起搏细胞并成功构建了生物起搏器。也有研究用起搏细胞特征标志物来分离的，Hashem等[16]用Shox2启动子和Cx30.2增强子从ESCs分离出的细胞也具有起搏细胞的特征，可作为生物心脏起搏器的种子细胞。Morikawa等[17]则从ESCs中直接分离出HCN+的细胞，Scavone等[18]则发现ESCs中CD166+的细胞可发育为窦房结样细胞，这些细胞高表达窦房结细胞发育的相关标志Tbx18、Tbx3、Isl-1和 Shox2等，以及功能标志 Cx30.2、HCN4、HCN1、CaV1.3等；并低表达心室肌基因Cx43、Kv4.2、HCN2、Nkx2.5。Jung等[19]用人Tbx3+MYH6作为启动子，从小鼠胚胎来源的多能干细胞中得到了80%以上的起搏细胞，而且搏动频率达到了每分钟300～400次。Rimmbach等[20]用同样方法，得到了80%以上的起搏细胞，而且搏动频率达到了每分钟400～500次，与正常的心肌细胞相似。最重要的是，上述研究获得的起搏细胞都可以在体驱动小鼠心肌细胞，为心脏组织工程和生物起搏器的构建研究提供了理想的种子细胞。

内皮素-1和神经调节蛋白-1在心脏发育中具有重要的作用[21-23]，也被用于促进鼠和人ESCs向起搏细胞的分化[24-25]。所谓的胚胎心脏祖细胞指的是取自胚胎心管的细胞。我们的研究发现，该细胞经诱导后可在体外形成窦房结样细胞[26-27]。此外，Wiese等[28]用苏拉明将小鼠ESCs诱导为窦房结细胞，证实了Ca2+激活的钾通道在诱导ESCs，以及ESCs源性心肌多能干细胞向起搏细胞分化中的作用[29-30]。

关于ESCs细胞的研究证实了ESCs可以向心肌或起搏细胞诱导分化，用于生物心脏起搏器的构建，但这些细胞始终存在伦理学的问题，免疫原性、成瘤性问题也一直受到关注。此外，控制ESCs分化、准确定向诱导等问题尚亟待解决。

2.2 成体干细胞

与胚胎来源的干细胞相比，成体干细胞具有以下优势：①获取相对容易；②来源于患者自身，不存在组织相容性问题，避免了移植排斥反应和使用免疫抑制剂；③理论上成瘤风险低，而且伦理学争议较少。成体干细胞中以骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）和脂肪来源的干细胞（Adipose-derived stem cell，ASCs）应用较多。但是，一般认为成体干细胞不具有心肌或起搏细胞相应的离子通道或相关结构，向起搏细胞的分化相对困难，只有通过转基因或特殊的诱导方法才能获得起搏细胞的特性。

2.2.1 起搏基因转染

Potapova等[31]采用电穿孔转染的方法将HCN2基因转入hMSCs，然后移植到犬左室的心外膜下，可形成异位起搏点，植入的细胞与邻近心肌细胞形成了缝隙连接。Plotnikov等[32]进行了类似的实验，持续观察了6周，并对注射细胞的数量进行研究，发现细胞数须大于700 000个。Lu等[33]将小鼠的HCN4转染至犬骨髓MSCs，再注射至完全房室阻滞的犬左室前壁，最大心率快于正常组，运动后的心律变异度高于正常组。Zhang等[34]用腺病毒将HCN4基因导入猪（自体移植）完全心脏阻滞的右室壁，2周后心率提高，对肾上腺素产生反应。更多的研究在体外证实，通过多种方法将HCN转染至MSCs，MSCs可以有心肌或起搏细胞的一些特征标志物，产生If[35-37]。Valiunas等[38]共培养HCN转染细胞与心肌细胞，观察到Connexin-40、Connexin-43和Connexin-45均高度表达，通过这种缝隙连接，心肌从HCN转染细胞获得到了If，表明HCN转染细胞须与心肌细胞形成一个起搏单元，才能完成起搏功能。Nong等[39]将鼠HCN4转染至大鼠MSCs，再移植至心室肌片，发现HCN4-MSCs只产生If，而未产生理想的动作电位或去极化激活的内向钠流或钙流，似乎也验证了以上说法。若在MSCs转染HCN的同时，再过表达Cx45，则与其共培养的心肌细胞跳动频率会大大提高[40]。

2.2.2 化学诱导法

5-氮胞苷作为诱变剂主要用来将干细胞诱导分化为心肌细胞。Wakitani等[41]首次证实5-aza可诱导MSCs分化为肌性细胞。Makino等[42]研究发现，5-aza诱导后的骨髓MSCs能观察到自发跳动和类似心肌细胞的动作电位；RT-PCR的结果表明，诱导后的细胞含有心肌RNA。Rangappa等[43]首次用5-aza将脂肪来源的ASCs诱导为跳动的心肌细胞。按照各类心肌细胞的特点，上述诱导后的细胞已经具备了起搏细胞特征。Yang等[44]比较了骨髓和脂肪来源的MSCs向起搏细胞分化的能力，认为ASCs更容易被诱导，其HCN的表达也高于BMSCs源性起搏细胞。然而，更多的研究没有能够观察到5-aza诱导后的BMSC或ASCs出现跳动，但大部分可以表达心肌细胞的标志，这可能与种属、细胞来源、5-aza的浓度以及培养的方法有关。Otaka等[45]用5-aza处理Nanog+的人羊膜上皮细胞，细胞可以表达HCN4和Kir2.1。值得注意的是，5-aza是一种细胞毒性物质，剂量过大可导致细胞死亡，而小剂量的5-aza又不能使MSCs向心肌细胞分化；另外，5-aza还具有致突变作用。因此，该方法诱导起搏细胞只能用于体外实验研究，诱导出的起搏细胞也未见用于在体研究。

2.2.3 心肌细胞或窦房结细胞微环境培养法

微环境是影响干细胞分化的重要因素，因此利用心肌细胞、窦房结细胞共培养，或者用心肌细胞裂解液、条件培养液等诱导成体间充质干细胞向心肌细胞或窦房结细胞分化的方法被广泛采用。分化后的细胞能否收缩或搏动，各研究报道不一，可能与细胞来源、状态、培养条件及时间有关。尤其是分化后的细胞是否具有起搏细胞的特性，更是较少涉及。对BMSCs，有报道肯定了在心肌微环境下可以表达起搏细胞相关标志[46]，部分研究还测到了If[47-48]。 宋波等[49]用大鼠窦房结组织与大鼠MSCs共培养，随培养时间延长（1～3周），PCR和免疫荧光都显示Cx40和HCN4 mRNA和蛋白表达水平均逐渐增加。

在对ASCs在心肌组织微环境下起搏细胞的分化研究中，但大多数未观察到分化的细胞产生跳动，有些是观察到了细胞的“跳动”，但对起搏特性的鉴定证据不足。Gaustad等[50]将人皮下脂肪来源的ASCs置于含有大鼠（4～6周龄）心肌提取液的培养基中，3周后细胞出现跳动现象，但未检测起搏细胞标志。只有Choi等[51]研究发现，取人皮下ASCs，与新生大鼠心肌细胞共培养（接触），1周时细胞就有自主搏动，可检测到钙瞬变，与周围心肌有缝隙连接，并同步收缩，具备了一定的起搏细胞特征。

2.2.4 脂肪来源干细胞“自发”分化

上述各种方法使成体干细胞诱导为起搏（样）细胞，或多或少都有一定的局限性。其他众多研究，则在寻找能够“自发”地分化为起搏细胞的方法。所谓“自发”，主要指不需要加特殊的诱导剂，可能在培养基内某些未知的因素作用下，成体干细胞也可以像ESCs一样，可以“自发”地向起搏细胞分化。Planat-Bénard等[52]首次证实了取自鼠腹股沟和肩胛部的ASCs在甲基纤维素培养基中，可以自发地分化为跳动的心肌细胞，细胞能产生自发动作电位，并提供了药理学检测证据，他们认为是心肌细胞中混有起搏细胞。Palpant等[53]使用相似的培养基培养取自小鼠肩胛区的ASCs，也得到了一致的结果，并初步研究了其分化机制，提示了Wnt通路在其中的作用。首先，他们在研究中没有严格区分棕色脂肪和白色脂肪，后来的研究表明，这些能够分化为起搏细胞的干细胞主要来源于棕色脂肪[53-54]；其次，这些研究都采用了甲基纤维素培养基，其相关机制并不清楚，有可能是培养基中的细胞因子和化学诱导剂对这种分化具有促进作用；最后，他们对跳动细胞的起搏特性研究较少涉及。2006年，Yamada等[55]最早从小鼠棕色脂肪组织中分离出CD29+干细胞，在常规培养条件下（不用甲基纤维素培养基）获得了部分自发跳动的心肌样细胞，认为棕色脂肪组织中存在着心肌定向分化祖细胞。后来该小组又发现，BASCs中CD133+的细胞在体外向心肌分化的比例最高，可以达到50%[56]。Liu等[57]改进了分离细胞的方法，提高了跳动的心肌样细胞的比例。但三者都未对跳动心肌细胞的起搏特性进行研究。2009年，Takahashi等[58]利用BASCs源性的起搏细胞治疗小鼠房室传导阻滞，50%的小鼠传导阻滞得到改善。Jumabay等[59]在对小鼠的去分化脂肪细胞给予20%胎牛血清培养14 d后，发现细胞表达心肌表面标志，其中一些为自发跳动的心肌样细胞，并且具有4期自动除极化的特点，证实了自发跳动的心肌细胞具有起搏细胞的特性。本实验室的前期工作也已证明了来自小鼠的棕色脂肪源性干细胞和去分化脂肪细胞，在体外可以定向分化为自发跳动的心肌细胞，并进一步证实了脂肪源性干细胞分化成的自发跳动的心肌细胞具有起搏细胞特征[60-61]。因此，虽然还有很多问题要解决，但ADSCs细胞极有可能成为理想的生物起搏器的种子细胞来源之一。

2.3 诱导性多能干细胞

自从2006年Takahashi等[62]报道了关于诱导性多能干细胞 （Induced pluripotent stem cells，iPS）的研究成果以来，iPS迅速成为干细胞领域的研究热点。在干细胞源性的心肌中，存在着一些细胞具有窦房结细胞的特征[63]，但这种细胞的比例较少，甚至是一过性的[64]。Ma等[65]用心脏MYH6启动子从iPS源性心肌细胞中筛选出杀稻瘟素（Blasticidin）抗性的高纯度心肌细胞，可借鉴到起搏细胞的提纯中。Semmler等[66]将未分化转录因子1（Undifferentiated transcription factor 1，UTF1）作为启动子，从鼠iPS源性心肌细胞中得到了以表达HCN、产生If为主的细胞群。Mandel等[67]通过hESC和iPSC源性的心肌细胞进行了15 d细胞外电生理学观察，发现其跳动频率非常稳定，适合作为生物心脏起搏器的种子细胞。

3 问题与展望

生物心脏起搏器的研究虽已近20年，但面临的困难还有很多。其中，细胞移植存在以下问题：移植细胞容易弥散，难以与周围细胞形成连接导致重建或修复功能下降；移植部位及移植数量的选择，也会影响重建、修复的起搏或传导功能的正常发挥。相比之下，组织工程构建生物起搏器成为一个较为理想的选择。构建一个起搏或传导组织植入体内发挥作用，涉及到种子细胞与材料的相互作用。三维材料载体携带细胞进入体内能够克服细胞移植的诸多缺陷。很多研究表明，组织工程方法可明显改善细胞移植产生的问题。机体细胞所处的微环境对该细胞生理功能的发挥起着重要的作用。因此，深入探讨起搏细胞所处的微环境，包括细胞外基质（ECM）、支持细胞、可溶性物质（细胞因子、生长因子等）对起搏细胞功能或传导功能的影响也很重要。此外，生物心脏起搏器的成功构建还依赖于对窦房结等起搏、传导结构调控机制的阐明。相信随着研究的不断深入和生物技术的不断发展，生物心脏起搏器必将取代电子起搏器而应用于临床。

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Advances of Seed Cells for Constructing Biological Pacemaker

JI Ruijuan,YANG Xiangqun.Research Center of Regenerative Medicine,Department of Human Anatomy,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China. Corresponding author:YANG Xiangqun(E-mail:yangxq@smmu.edu.cn).

【Summary】 With the rapid development of stem cells,tissue engineering and regenerative medicine,cell transplantation and tissue engineering to construct biological pacemaker are expected to become the future direction.It is very crucial to find the ideal seed cells.Nowadays,the seed cells used for constructing the biological pacemaker includes:adult cells and stem cells.In this paper,the advances of seed cells for constructing biological pacemaker were reviewed.

Biological pacemaker;Adult cells;Stem cells

R318.11

B

1673－0364（2015）06－0381－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.06.010

2015年9月20日；

2015年11月8日）

国家自然科学基金（31170934）。

200433 上海市 第二军医大学解剖学教研室再生医学研究中心。

杨向群（E-mail：yangxq@smmu.edu.cn）。