抗菌材料生物学性能的检测方法

徐启明 周晟博 综述 冒海蕾 王斌 审校

抗菌材料生物学性能的检测方法

徐启明 周晟博 综述 冒海蕾 王斌 审校

抗菌材料可分无机、有机天然和有机合成三种类型，需通过抗菌性能、生物相容性及材料性能等的一系列生物学性能检测。本文就抗菌材料的生物学性能检测方法进行综述。

抗菌材料 抗菌性 生物相容性 材料性能

1 抗菌材料的分类

抗菌材料是具有杀菌、抑菌作用的功能材料，可分为无机、有机天然和有机合成三种类型。

1.1 无机抗菌材料

无机抗菌材料具有安全性高、耐热性好、无挥发、不产生耐药性的特点[1]，分为金属离子型和光催化型。

金属离子型抗菌材料是将具有抗菌性能的银、铜、锌等金属离子，通过物理吸附、离子交换等方法固定到沸石等载体上，其中以银离子的抗菌性最强[2]，10-6即可杀灭细菌。商品化的无机抗菌材料多为银系，但价格昂贵，加工和使用时易着色、变色。

光催化型无机抗菌材料是指N型半导体金属氧化物，如TiO2、ZnO、SiO2等。其中，TiO2的氧化活性较高，稳定性强，对人体无害，具有优良的广谱抗菌效能[3]，但加工困难，再现性差，必须在光照条件下才有效，抗菌效果的评价也较困难[3]。

1.2 有机天然抗菌材料

有机天然抗菌材料以壳聚糖为典型代表，壳聚糖是一种价廉的天然高分子，具有广谱抗菌性，对人体无毒、无刺激[4]。通过羧甲基化改性壳聚糖形成的羧甲基壳聚糖生物相容性更好[5]，其抗菌性能受pH值、相对分子质量和脱乙酰度的影响，一般在pH值5.5～6.5、相对分子质量10 000～100 000时抗菌性能强，超出此范围或脱乙酰程度增加，其抗菌效果就不稳定，耐热性也变差[4，6]。

1.3 有机合成抗菌材料

有机合成抗菌材料分为低分子与高分子两类，后者是在前者的基础上高分子化形成。有机高分子抗菌材料的抗菌效果优于有机低分子抗菌材料，且毒性较低。

有机高分子抗菌材料具有两亲性及阳离子型的特征[7-9]，溶于水、发生电离可产生带正电荷的亲水基团，发挥抗菌性能，故又称阳离子型抗菌材料。该类材料主要通过静电吸引发挥抗菌效果，而人体细胞表面所带负电荷很低，与阳离子型抗菌材料的静电吸引作用很小，故此类材料对细菌的杀伤作用具有选择性，生物相容性好。根据亲水抗菌基团的不同，目前研究主要集中于季铵盐类、季磷盐类、吡啶盐类以及咪唑盐类等。

2 抗菌材料生物学性能检测

理想的抗菌材料应具有高效、广谱、持久的抗菌性能，良好的生物相容性，且易于合成。研发抗菌材料需通过抗菌性能、生物相容性、材料性能等的一系列生物学性能检测。

2.1 抗菌性能检测

通常根据材料的性质、用途，选择细菌种类及接触方法，并使材料与细菌接触一定时间后测定抗菌性能。通常选用国际公认的标准菌株，如大肠杆菌[10]、金黄色葡萄球菌[10]、白色念珠菌[11-12]等。接触方式有薄膜密封法、滴下法、晃动法/烧瓶振荡法、纸片扩散法等。

2.1.1 平板菌落计数及OD值测试

将一定量与材料作用后的菌液接种到含培养基的平板上，一定温度下进行培养，形成肉眼可见的菌落，一个菌落代表一个细菌，统计实验样品（B）和阴性对照样品（A）的平均菌落数，计算抑菌率(%)=(A-B)/A×100%。该法能直观地统计细菌数量，即使细菌很少也可测出；但是，当细菌的菌落排列过密、融合时，会影响计数准确性，产生较大的误差。

由于菌体的散射及吸收作用，不同浓度的细菌悬液，光密度不同，一定范围内，细菌悬液浓度与光密度呈正比，通过酶标仪测定细菌悬液OD600值，计算抑菌率(%)=(阳性对照值-实验值)/(阳性对照值-阴性对照值)×100%。抑菌率≥50% ～90%，材料有抑菌作用；≥90%，则抑菌作用较强[2]。

2.1.2 细菌染色计数法

LIVE/DEAD细菌染色计数法可了解抗菌材料是否有杀菌作用，该法运用SYTO9与PI（碘化丙啶）两种荧光染料。SYTO9可穿过完整细菌的细胞壁，与DNA结合，在510 nm处显示绿色荧光的活菌；而PI只沉积在不完整的细菌细胞壁中，在630 nm处显示红色荧光的死菌，从而区分LIVE/ DEAD细菌，统计相应细菌数量[13]。

2.1.3 抑菌圈法

抗菌材料通过扩散，在纸片周围形成浓度梯度，使细菌生长受到抑制，形成透明的抑菌圈；抑菌圈越大，抑菌效果越显著[14-15]。但该法只适用于测试可溶性材料且生长快速的细菌，同时受接种细菌的含量与分布、纸片的质量和纸片含抗菌材料的均匀性等因素的影响。

2.1.4 最低抑菌浓度检测

最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）指可抑制某种微生物出现明显增长的有效浓度。MIC法主要用于检测可溶性的抗菌材料，常用方法包括：常量/微量肉汤稀释法和琼脂稀释法等[14，16]。抗菌材料经梯度稀释与定量细菌混合培养后，通过测定OD600nm、平板菌落计数及抑菌圈法，寻找低于对照组50%以上的材料浓度，即为MIC。

2.1.5 细菌表面Zeta电位

细菌细胞壁磷壁酸、革兰染色阴性菌外膜中的脂多糖均带有负电荷，这层负离子与溶剂之间的界面形成流体剪切面，Zeta电位即为该界面的电位[17]。Zeta电位是一个表征分散体系稳定性的重要指标，其绝对值的大小与细菌细胞结构的稳定性呈正比[18]。测定细菌表面Zeta电位的变化，可证实材料是否降低细菌细胞结构的稳定性，发挥抗菌作用。

Zhu等[19]将合成的阳离子型抗菌材料与细菌作用后，发现大肠杆菌表面Zeta电位由正常的 （-21.0±0.9）mV降为-（4.8±0.2）mV。可见，该材料溶于水发生电离，带正电荷的亲水基团与细菌带负电荷的磷壁酸或脂多糖之间产生静电吸引作用；抗菌材料中正电荷转移，使细菌表面所带负电荷减少，Zeta电位绝对值变小。

2.1.6 过氧化作用检测

DCFH-DA（2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐）法是传统组织活性氧荧光定量测定方法，也可测定细菌细胞内ROS水平。无荧光的DCFH-DA可自由穿过细菌细胞壁及细胞膜进入细菌内，脱去乙酰基，生成无荧光的DCFH；DCFH与细菌细胞内ROS反应，产生有荧光的DCF，检测DCF荧光强度可以评测细菌细胞内ROS水平。

另外，ADPA[9,10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸]法可特异性地检测ROS中的1O2。ADPA可选择性与1O2结合，并迅速生成相应的内氧化物，通过测定ADPA在355 nm处吸光度的减少量，即可反映细菌细胞内1O2的含量。这些方法也有助于阐明材料的抗菌机制。

2.2 生物相容性测试

生物相容性是指生物材料与生物体之间相互作用产生的结果，以及机体对此结果的忍受程度。抗菌材料必须通过一系列生物相容性检测，才可能应用于人体。医用材料要求材料的化学性质为惰性，不与人体组织、血液、免疫等系统产生不良反应[20-21]。生物相容性测试分两步：先通过体外测试，如细胞毒性、溶血实验等；再根据其性质、用途，进行实验动物的体内测试，包括植入后局部反应、刺激性、致敏性、全身毒性、遗传毒性和致癌性检测等[21]。

2.2.1 细胞毒检测

细胞毒性实验是通过体外细胞培养，检测接触材料后的细胞是否发生生长抑制、功能改变、溶解、死亡等生物学反应，以评价材料潜在的细胞毒性，预测体内组织细胞反应。细胞毒性是最重要的生物学性能评价指标之一，直接接触或植入人体的材料都需进行细胞毒性测试。

国家卫生部/国际标准化组织标准 （GB/T 16886.5-2003/ ISO 10993-5∶1999）推荐三类细胞毒性实验：浸提液法、直接接触法及间接接触法（包括琼脂覆盖法、分子滤过法），推荐使用ATCC CCL1（NCTC clone 929、小鼠成纤维细胞）或ATCC CCL2（Hela细胞、人上皮细胞）标准细胞株进行毒性测试。目前，除了经典MTT法，还出现了简便、快速的改良方法，如CCK-8法、MTS法等。

MTT法：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶性的蓝紫色甲瓒结晶，并沉积在细胞中，DMSO（二甲基亚砜）能溶解甲瓒，通过测试溶解产物OD490nm，反映活细胞的数量[22]。

CCK-8法：WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]被线粒体内脱氢酶直接还原生成高度水溶的橙黄色甲瓒产物，省去了溶解步骤，通过测试OD450nm，反映活细胞的数量[23]。该法线性范围更宽，灵敏度更高，毒性更小，重复性优于MTT法，已广泛用于细胞毒性的检测。

运用MTT法或CCK-8法测得OD值后，可计算细胞生长增殖率，RGR(%)=(实验值/对照值)×100%。根据RGR分五级：99%以上为0级；75%～99%为1级；50%～74%为2级；25%～49%为3级；1%～24%为4级；1%以下为5级。0级或1级表示材料毒性低；2级则应结合细胞形态做综合分析；3～5级表示材料毒性大[24]。抗菌材料对细胞的毒性作用最先表现为细胞膜的变化，因此细胞膜完整性测定也是细胞毒性检测的方法之一[21]。将与抗菌材料接触后的生物细胞与FDA（乙酰乙酸荧光素）及PI（碘化丙啶）进行共培养，FDA可穿过完整生物细胞膜，并被细胞内酯酶转化为荧光素，在520 nm处显示胞内绿色荧光；而PI不能穿过完整的生物细胞膜，但在生物细胞膜破坏的情况下，PI可进入生物细胞内，并嵌入双链DNA与之紧密结合，在630 nm处显示胞内红色荧光。

2.2.2 溶血实验

溶血实验用来检测红细胞是否破裂[25]。肉眼观察结果判断分为4种：完全溶血（溶液澄明红色，管底无红细胞残留）、部分溶血（溶液呈明红或棕色，管底少量红细胞残留）、无溶血（溶液无色透明，红细胞全部下沉）、不溶血（管底红细胞凝集，且振摇后不能分散）。对于医用注射制剂，要求3 h内不出现溶血和凝集反应；如0.5 h出现完全/部分溶血或凝集反应，则不能静脉内使用。

定量检测可通过测定溶液的吸光度值，计算溶血率。溶血实验的阳性对照可选用红细胞悬液加等体积蒸馏水，以造成低渗性溶血；也可选择破坏红细胞膜的溶液，如2%的Triton X-100，能去除红细胞膜上的蛋白质，在较短时间内破坏红细胞。阴性对照则将红细胞放入生理盐水中，维持红细胞所需的等渗环境。实验组则在红细胞悬液中加入抗菌材料，接触一定时间后，离心取上清，测定 OD 545 nm[26]或者OD 576 nm[27]，计算溶血率(%)=(实验值-阴性对照值)/(阳性对照值-阴性对照值)×100%。非直接接触的生物医药材料要求溶血率≤5%[25]。

2.2.3 植入实验

植入实验将材料置于动物体内一定部位，如皮下[28]、骨[29]、腹腔[30]和结膜囊[31]等，一段时期后观察局部以及全身的变化，评价材料生物相容性和安全性。通过组织切片可观察局部组织有无增生、炎症反应[31]；通过比较体重、进食、排泄、活动、呼吸、肝肾功能、存活等变化，观察有无全身毒性反应[30]；通过流式细胞荧光分选技术分析淋巴细胞亚群的比例变化，观察抗菌材料对机体免疫系统的毒性[32]。

对长期植入体内的抗菌材料，还需进行遗传毒性、致癌性及生殖毒性检测。从对DNA的影响、基因突变和染色体畸变三方面可反映材料遗传毒性；通过肿瘤的数量、大小、类型、发生部位和时间，判断材料致癌性。对于直接接触生殖系统的材料，则需进行生殖毒性检测。可通过DNA、RNA、蛋白质检测反映基因复制、转录及翻译的情况，尤其是针对一些抑癌基因及促癌基因[21]。

2.3 材料物理性能测试

抗菌材料的研制要以提高抗菌效果和生物相容性为主要目标，同时改善材料物理性能。材料性能包括抗污能力、吸湿性、稳定性等，且直接决定抗菌效果、抗菌持续时间及对机体的影响，这需要在材料结构的设计、载体的选择等研制阶段进行优化。

2.3.1 抗污能力（抗蛋白质黏附）

生物体内富含蛋白，材料表面非特异性吸附蛋白会造成体内细胞进一步吸附、铺展、增殖甚至死亡；与血液接触则可引起凝血、血栓等。理想的抗菌材料应具备良好的抗污能力。将材料置于牛血清白蛋白溶液中，取出后清洗，加入十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，SDS的磺酸根可与蛋白质的氨基结合形成强劲的离子键，从而将吸附于材料表面的蛋白质溶出，便可对材料吸附的蛋白质进行定量观察[27]。

2.3.2 材料吸湿性能

创面愈合需要一定的湿度，但湿度过高又易引起细菌的滋生，故抗菌敷料应具备合适的吸湿性。可根据单位质量/面积，计算材料的吸湿率，评价材料的吸湿性[30]。

2.3.3 材料的稳定性

重金属离子的存在、固定载体的差别以及抗菌离子电荷的分布，均可影响阳离子型抗菌材料的稳定性[31，33]。

新型抗菌材料的开发将有助于解决临床愈加严重的细菌耐药问题，具有广阔的应用前景。通过抗菌性能、生物相容性及材料物理性能的综合测试，将为其产业化推广及临床应用奠定坚实基础。

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Testing Methods for the Biological Performance of Antibacterial Materials

XU Qiming1,ZHOU Shengbo2,MAO Hailei2,WANG Bin1.1 Departments of Anesthesiology and Critical Care Medicine,Zhongshan Hospital,Fudan University, Shanghai 200032,China;2 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:MAO Hailei (E-mail:mao. hailei@zs-hospital.sh.cn);WANG Bin(E-mail:wangbin1766@163.com).

【Summary】 Antibacterial materials can be divided into three categories,inorganic,natural organic and synthetic organic. A series of biological performance testing are required for the new antibacterial materials,including antibacterial activity, biocompatibility and material properties.In this paper,the testing methods for their biological performance were reviewed.

Antibacterial materials; Antibacterial activity; Biocompatibility; Material properties

R318.08

B

1673－0364（2015）06－0386－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.06.011

2015年6月23日；

2015年8月27日）

国家自然科学基金（81101404，81271725）。

200032 上海市 复旦大学附属中山医院麻醉重症医学科（徐启明，冒海蕾）；200011 上海市 上海交通大学附属第九人民医院整复外科（周晟博，王斌）。

冒海蕾（E-mail：mao.hailei@zs-hospital.sh.cn）；王斌（E-mail：wangbin1766@163.com）。