骨髓间充质干细胞治疗脑梗死的研究进展

刘新华，曹亦宾

卒中是人类死亡和致残的主要原因之一，其中缺血性卒中大约占80%[1]。目前，仅有溶栓及介入治疗能有效恢复血管再通，但由于有限的治疗时间窗，只有少数患者能够受益。动物实验表明，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）移植能改善脑缺血后神经病学和行为学上的缺失[2]，下面对BMSCs治疗脑梗死的研究进展进行综述。

1 骨髓间充质干细胞生物学特性

BMSCs是骨髓中胚层间充质中一种成体干细胞，为原始造血细胞生长和分化提供必不可少的骨髓微环境[3]，参与造血细胞的黏附和归巢，且具有自我复制及多向分化潜能[4]。经过适当的诱导，BMSCs能够向软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等中胚层细胞分化[5]；此外，BMSCs能够分化为神经系统细胞，如神经元、神经胶质细胞、神经元样细胞等[6]。体外培养BMSCs，细胞呈长梭形，细胞表面标志CD73、CD90、CD105、CD44、CD9为高表达，而CD34、CD45、CD11b、CD14、CD19、CD79a表达较少[7]。目前BMSCs已经成为细胞替代疗法和组织工程学的研究热点。

2 骨髓间充质干细胞在实验动物脑梗死模型中的研究

据报道，啮齿类动物BMSCs对治疗动物脑梗死模型有一定疗效。Pavlichenko等[8]将鼠BMSCs通过静脉推注治疗永久性大脑中动脉梗死（permanent occlusion of middle cerebral artery，pMCAO）模型大鼠，治疗后3 d在梗死区和对侧半球均发现了BMSCs。该研究还发现，与对照组相比，治疗组大鼠的神经胶质细胞形成较快，炎症反应减弱，新生血管增多，室管膜下层梗死体积减少；水迷宫实验显示治疗14 d后，治疗组大鼠行为显著恢复，而对照组无明显改变。Keimpema等[9]在建立大鼠pMCAO模型2 h后通过血管推注鼠BMSCs，发现在脑梗死区出现移植细胞，而且治疗组大鼠梗死面积显著小于对照组。Liu等[10]利用慢病毒将绿色免疫荧光蛋白及生存素（Survivin，SVV）重组体基因重组至BMSCs内基因组，利用重组细胞治疗脑梗死大鼠，发现治疗后大鼠脑梗死区域血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）含量显著提高，且梗死体积在治疗后4 d比未治疗组减少5.2%，治疗后14 d发现，大鼠行为学功能也有显著改善。Miyamoto等[11]通过移植大鼠BMSCs治疗脑梗死大鼠，1周后，发现BMSCs能促进梗死区周围糖代谢，并改善大鼠神经功能恢复。

目前，不仅同种异体细胞治疗取得不错效果，利用人BMSCs治疗动物脑梗死模型也显示出了积极的效果。Byun等[12]通过动静脉两种途径于不同时间将人BMSCs用顺磁性氧化铁标记后治疗pMCAO模型大鼠，经头部磁共振成像显示动静脉两组的缺血半暗带低信号分布相似，病理学研究发现，移植细胞在缺血半暗带分布最多，建模48 h动脉移植组大鼠缺血半暗带区BMSCs较静脉移植组显著增多。另外，Heo等[13]也发现，人BMSCs治疗大鼠pMCAO模型后9～25 d，大鼠改良神经功能缺损程度评分较对照组显著提高。

3 骨髓间充质干细胞治疗脑梗死可能机制

过去神经保护性治疗多针对挽救神经细胞进行，而目前认为脑梗死诱发的损害是通过多种病理生理机制引起神经血管单元整体损害[14]。BMSCs可能通过神经再生、突触产生、分泌神经因子、血管新生等机制发挥治疗作用，与促进大脑可塑性的机制有相关性，这些因素能够修复神经血管单元，促进神经功能恢复。

3.1 刺激神经发生和突触形成 侧脑室室管膜下区（subependymal ventricular zone，SVZ）存在祖细胞，能够分化生成新的神经元。动物实验证明，这种分化功能是SVZ祖细胞特性，并且这种神经祖细胞可迁移流动到嗅球并分化为中间神经元[15]。缺血缺氧环境会刺激SVZ祖细胞数量增加，并且这些祖细胞可分化为新神经元，而同种BMSCs移植治疗大鼠脑梗死后，其神经祖细胞数量也增多[16]。Klionsky等[17]经颅内定位移植BMSCs治疗大鼠脑梗死，发现SVZ神经干细胞增多，而且新生干细胞的存活率升高，丘脑皮层的电路活动部分恢复，神经元和轴突密度显著增大，此外轴突生长蛋白（axonal growth associated protein-43，GAP-43）含量增多，轴突生长抑制蛋白数量减少。

3.2 神经保护作用 Chen等[18]静脉推注BMSCs治疗脑梗死大鼠，发现大鼠神经功能部分恢复，并从大鼠脑组织提取物中分离出脑源性神经生长因子（brain derived neurophic factor，BDNF）、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、VEGF和肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF），认为BMSCs能通过分泌这些营养因子增强治疗效果。另外，体外培养BMSCs的研究发现，培养皿中有低水平的BDNF表达，而经静脉移植BMSCs治疗大鼠pMCAO模型后，大鼠脑梗死区域BDNF表达增加[19]，凋亡细胞减少，内源性细胞增殖增多，并且同侧半球存活细胞及少突细胞前体细胞的数量也增多[20]。研究推测BMSCs可能通过促进多种神经营养因子分泌起到神经保护作用[21]。

3.3 免疫调节作用 急性pMCAO后免疫调节在脑损伤和脑保护中都有重要作用。有动物研究显示，脑缺血能够诱导BMSCs的动员，使其迁移至损伤部位发挥作用，其可能机制是受损组织微环境出现特定的分子信号，例如基质细胞衍生因子-1/配体CXC型趋化因子受体（stromal cell derived factor-1/CXC chemokine receptor 4，SDF-1/CXCR4）轴，使移植后的BMSCs归巢至缺血组织，发挥治疗作用[22]。还有研究认为BMSCs的免疫调节包括抑制T细胞、B细胞、自然杀伤细胞的增殖，同时抑制中性粒细胞的呼吸性爆发，减少树突细胞的抗原提呈功能，减弱缺血后的炎症损伤[23]。另外，有研究显示BMSCs移植后可促进转化生长因子-β、HGF、一氧化氮、吲哚胺2，3-双加氧酶等可溶性因子的产生，通过抑制细胞之间的直接接触发挥免疫调节作用[11]。

3.4 细胞因子的作用 脑梗死后缺血区脑组织炎症反应会加重脑损伤区域损伤。动物实验发现，同种异体BMSCs静脉移植治疗鼠pMCAO模型，可以通过上调IL-6和IL-10表达，调节大脑内微环境，减少细胞凋亡，发挥抗炎作用；另外，BMSCs静脉移植后大鼠肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）水平降低，也可以减弱炎症反应[24]。有研究同时通过动静脉移植同种BMSCs治疗大鼠pMCAO模型，两种途径都能够改善大鼠神经功能，但静脉组VEGF、BDNF、bFGF等细胞因子显著高于动脉组，推测动脉和静脉移植BMSCs，其对细胞因子分泌的作用机制可能有所不同[25]。

3.5 刺激新生血管形成 体外培养的BMSCs能够分泌VEGF和血管生成素-1（angiogenin-1，Ang-1）[26]。VEGF在大脑中有生血管的作用，能激发未成熟血管的形成。Ang-1在血管的成熟、稳定和修复方面都起作用并能促进脑内血管的形成。同时Ang-1能阻止外围血管的渗透，从而可减轻脑梗死后的脑水肿，发挥抗炎作用[27]。

促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是各种细胞经低氧预处理后产生的一种关键因子，低氧激活缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducing factor 1 alpha，HIF-1α），而后使EPO表达增多，且缺氧时间越长，其HIF-1α含量越多，EPO含量随之增多，促红细胞生成素受体（erythropoietin receptor，EPOR）也增多[28]。联合应用EPO和BMSCs治疗脑梗死，能够提高VEGF的水平，改善神经功能恢复[28]。将EPO基因修饰的BMSCs治疗大鼠pMCAO模型也发现，神经保护因子如BDNF，血小板衍化内皮细胞生长因子，HGF，基质细胞衍生因子1α（stromal cell derived factor 1 alpha，SDF-1α）和缺血再灌注损伤与转化生长因子β1表达均有提高，且治疗组大鼠神经功能恢复较对照组显著改善[28]。

4 提高骨髓间充质干细胞治疗效果途径

动物实验证实，BMSCs治疗脑梗死有一定效果，但由于BMSCs在体内存活时间较短，移植后不久大多数细胞就消失了，所以治疗效果有限，为了提高细胞治疗效果，国内外学者做了大量的实验进行探索。

4.1 BMSCs的低氧预处理 缺血/低氧预处理各种类型细胞、组织或者器官，其益处已被大量实验证实[20，29-31]，经低氧预处理可以显著提高移植细胞的存活和再生能力。Luskin等[32]利用低氧预处理的BMSCs治疗鼠pMCAO模型，与未低氧处理对照组相比，预处理组再生性营养因子VEGF和BDNF释放较多；刺激并调节干/祖细胞向损伤区域迁移的SDF-1增多，而其受体CXCR4没有显著增多；GAP-43显著增多，而ROCK Ⅱ和NG2细胞受到抑制减少，这些均有助于促进血管与神经的重塑以及脑皮质环路的修复[33]。Wei等[34]的研究显示，移植前对BMSCs进行低氧预处理治疗大鼠pMCAO可以促进BMSCs存活、迁移及归巢至缺血脑组织区域。还有研究通过常氧及低氧预处理的BMSCs分别治疗脑梗死大鼠模型发现，两组的BMSCs在移植后1.5 h均能到达缺血皮层及沉积在血管外，而低氧预处理组有较高水平的与细胞迁移归巢有关的蛋白表达，包括 CXCR4、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）及MMP-9等。Luskin等也发现低氧处理BMSCs组比常氧组表现出更强的迁移能力，且低氧能显著提高移植细胞归巢至梗死皮层[32]。

4.2 能提高BMSCs存活率的培养皿 在普通的组织培养基中，BMSCs能快速贴壁生长，很难进行神经诱导，即使在低附着面的培养基中也仅有8%的BMSCs转变成神经球样聚合物[35]。最近有研究[36]将高度疏水性的DTOPV放置在细胞培养基内培养BMSCs，可以见到表面疏水的神经元样细胞生长，移植后见到神经干、祖细胞的普遍标记的表达，表明BMSCs有分化为神经外胚层的潜能，超低的黏附表面使细胞能够持久保持球形，提高存活率。

4.3 对BMSCs的基因修饰 Scheibe等[25]将细胞凋亡抑制素与BMSCs结合，或是用抗凋亡基因修饰BMSCs后再进行移植，发现能有效促进脑梗死大鼠神经功能恢复。Fu等[37]用SVV修饰BMSCs后治疗脑梗死大鼠发现能提高BMSCs存活数量，显著增强VEGF和bFGF表达，减小大鼠脑梗死面积，改善其神经功能。Samoilov等[35]用Ang-1基因修饰BMSCs治疗鼠pMCAO，发现脑损伤区有较多新生血管形成。解燕春等[38]用慢病毒介导bFGF基因修饰BMSCs后治疗大鼠脑梗死模型发现显著增加脑梗死灶周围新生血管数量并促进大鼠神经功能恢复。此外，有人分别利用BDNF基因[19]、VEGF基因[39]、神经营养因子基因[40]等修饰BMSCs治疗脑梗死动物模型，较单纯应用BMSCs，基因修饰组的动物神经功能恢复均有所提高。目前对基因修饰BMSCs的动物研究有一定进展，但临床治疗较少，未形成统一的认知。

5 临床试验

2005年，Bang等[41]利用自体BMSCs静脉推注治疗美国国立卫生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）在7分以上的脑梗死患者，发现能改善患者1年后的改良Rankin量表（modified Rankin Scale，mRS）评分。然而这个研究有一定的局限性，如30例符合入组条件的患者中仅有5例接受细胞治疗，明显少于对照组的人数；由于移植细胞要在体外大量扩增，首次移植在卒中后第4～5周，第2次移植在第7～9周，移植时间较迟，可能影响了治疗效果。此研究随访5年，BMSCs治疗组与对照组相比死亡率无显著差异，没有发现BMSCs治疗有严重的不良反应[42]。2009年，Suárez-Monteagudo等[43]利用自身BMSCs治疗脑梗死，1年后发现患者mRS评分降低，且未出现与细胞治疗相关的副作用。在Honmou等的实验中，选取了灰质梗死、白质梗死以及混合梗死的患者12例，卒中后36～133 d通过静脉注射BMSCs，未发现与细胞治疗相关的不良反应，细胞治疗7 d后磁共振成像显示实验组患者脑梗死体积比对照组减少20%[44]。Prasad等[45]的实验中11例患者同样未发现严重的不良反应，并且在细胞治疗后6个月发现，7例患者有良好的临床结局，其mRS评分≤2或者Barthel指数为75～100分。

BMSCs是一种较容易获得的干细胞，在动物实验中证实，移植后不需要使用免疫抑制药物。但目前还没有统一的细胞治疗方案，如移植细胞的数量，细胞移植前的准备，移植时间窗等问题还需要进一步研究。科研工作者在提高BMSCs治疗效果方面做了大量研究，但是目前还没有就某一种方法达成共识，需要进一步就提高疗效方面进行探索。此外，细胞移植在有些动物实验中并未检测到不良反应，但这种方法是否真的有利无害，科研人员需要进一步探究其可能潜在的短期和长期的毒性反应和副作用。

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