纳米细菌及其与结石性疾病的研究进展

王晶晶　朱明利　刘寿荣★

纳米细菌及其与结石性疾病的研究进展

王晶晶朱明利刘寿荣★

纳米细菌（NB），又称为纳米钙化颗粒（CNP），是纳米级的球形或球杆状颗粒，它是单纯的晶体结构还是新的生命形式是现代微生物学一个最大的争议，虽然纳米细菌的性质仍在争论中，但对其的研究已经在医学领域展开，尤其与病理性钙化疾病的研究取得了较大的进展，本文就其做一综述。

1　纳米细菌

1.1纳米细菌的生物学特征 纳米细菌是芬兰科学家Kajander等［1］在胎牛血清中首先发现并命名的特殊生物微粒，直径约80～ 500nm，革兰染色阴性，呈球状或球杆状，细胞壁厚，无荚膜与鞭毛。广泛存在于矿物质中和生物体内，存在于人体的血液、尿、胆汁、前列腺液和其他许多器官组织中。Kajander等［1］将从胎牛血清中分离得到的纳米细菌进行16S r RNA检测，并将其归类于α2亚群布鲁菌（包括巴尔通体属和布氏杆菌属）。由于缺乏令人满意的16SrRNA 序列，故又称其为纳米钙化颗粒（CNP）。其具有独特的生物矿化特性：在pH7.4的生理性钙磷浓度中，能分泌羟基磷灰石类的钙化物，形成矿化的生物被膜，覆盖于菌体周围，使其能耐受高温、强酸等多种不利理化因素，并能抵抗多种抗生素的打击。1.2 纳米细菌的培养 纳米细菌培养条件：37℃、pH7.4、5%CO2，细胞培养基DMEM或RPMI1640，加入10%胎牛血清更利于繁殖，但其仍生长缓慢。NB倍增时间为3d，传代1次/月，可连续传5年，并能保持原有的生长特性。有文献报道在培养基中加入碱性磷酸酶可加速其生长。郭亚楠等［2］对纳米细菌的培养进行探讨，一方面改进培养基，将10%胎牛血清的浓度提高到30%，认为既增加了营养，又减少了因为换液而带来的污染；另一方面，分别采用细菌培养箱和细胞培养箱进行纳米细菌培养，结果显示在生长速度方面两者差异不大，但是两组纳米细菌的外壳状态差异明显，细胞培养环境下纳米细菌只有少量矿化外壳，而细菌培养环境下纳米细菌产生很厚的矿化外壳。

1.3纳米细菌的检测 目前对纳米细菌的检测主要包括：

免疫组化染色法、透射电镜扫描法、钙染色法、PCR法、Hoechst33258DNA染色法等。但以上方法存在着一定的非特异性，故一般联合采用多种方法对其进行检测鉴定。（1）免疫组化染色法：是公认的金标准。利用无水乙醇/乙醚（1：1）混合液固定15min，采用SABC法。判断标准：在高倍视野可见微小的黄色至棕黄色杆状或球状颗粒者为纳米细菌。（2）间接免疫荧光法：一般采用单克隆抗体免疫荧光法。4%多聚甲醛固定15min，水洗70℃烤10min，滴加一抗（8D10），37℃孵育60min，PBS冲洗（2min×3次），滴加二抗，37℃孵育40min，PBS冲洗（2min×3次），80%甘油封片，荧光显微镜下观察。判断标准：高倍视野下可见绿色的杆状或球状颗粒分布。（3）透射电镜扫描（负染法）：将标本用2.5%的戊二醛固定，将细菌稀释液滴在有膜的铜网上，静置数分钟后，用滤纸尖吸掉，用3%磷钨酸染色1～2min，置于电镜下观察照相。判断标准：呈球状或球杆状，大小100～500nm，菌体周围有一层黑色物质包绕。（4）扫描电镜法：将培养物低温离心沉淀（14000g、4℃、30min），沉淀用PBS反复冲洗3次，3%戊二醛固定（4℃、2h），1%四氧化二锇（4℃、1h），梯度乙醇脱水，临界点干燥，真空喷金，扫描电镜下观察。判断标准：纳米细菌成簇成长，球状或杆状，外壳呈毛刺状。（5）钙染色 包括Dahl McGee-Russel茜素红钙染色和Von kossa染色法。Dahl McGee-Russel茜素红钙染色：将标本涂片固定，2%茜素红2s染液初染2～5min，0.2%淡绿水溶液复染20～30s，0.5%醋酸水溶液速洗；95%乙醇和100%乙醇脱水，烘干后用二甲苯透明中性树胶封固，显微镜观察。判断标准：油镜下观察纳米细菌体积极其微小，聚集成簇。Vonkossa染色法：标本滴于载玻片上，放入5%硝酸银溶液中避光15min，于紫外灯下照射15 min，冲洗3 min，5%硫代硫酸钠水溶液处理，冲洗3 min，0.1%核固红染液复染1 min，蒸馏水洗3 min。判断标准：染色后纳米细菌呈棕褐色。（6）PCR法：对用PCR法检测纳米细菌存在很大的争议，有学者认为纳米16sRNA序列与周围环境中的污染菌高度同源，故认为PCR法对纳米细菌的鉴定没有任何意义。但有些学者亦认为PCR法不需要培养，缩短了检测的时间，减少了污染，是简单、快速、低成本的检测方法。郭桂林［3］分别用PCR和ELASA法检测肝病患者血中纳米细菌（NB），结果显示两种方法差异无统计学意义，认为PCR法对NB的检测是一可靠的检测方法。（7）Hoechst33258进行DNA染色：Hoechst33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光燃料，常用于细胞凋亡检测，也用于普通细胞核染色，或常规DNA染色。Kajander等将用Hoechst33258进行DNA染色，发现浓度由0.5mg/ml提高至5mg/ml，荧光显微镜下可见特征性的荧光。而Raoult等研究发现不着色。此外，还有荧光定量RT-PCR法，免疫电镜法等。

1.4关于纳米细菌的争议 争议主要体现在以下几个方面：（1）大小：纳米细菌的直径大约为80～ 500nm，研究认为一个具有自我复制能力的生命形式的最小尺寸大约为140 nm，但Glass等［4］研究亦发现支原体能达到更小的尺寸，仅含43个RNA编码基因和387个蛋白质编码基因，所以仅从大小不能判断NB是否为微生物。（2）新陈代谢：纳米细菌的新陈代谢极其缓慢，是普通细菌的万分之一，具有有限的新陈代谢。然而barba等［5］将H-NMR光谱用于评估NB培养基的代谢改变，结果显示培养6周的培养基与未培养的培养基没有区别，认为未检测到任何代谢活动。（3）自我复制：纳米细菌能进行自我复制，扫描电镜下可见到纳米细菌一分为二以及融合成一个团块等表现。但Young等［6］研究将其定义为仿生特性，包括细胞样和组织样的外形，具有生长、增殖和传播的能力，但其本质是被胎球蛋白包裹的纯粹的纳米羟基磷灰石颗粒。（4）16S rRNA：目前为止，仍缺乏准确的基因组序列，而其16SrRNA又被有些学者认为是实验污染。有学者发现纳米细菌的16SrRNA 同紫金牛叶杆菌几乎相同。Barba等［5］将培养6周的CNP进行实时PCR，在排除已知的细菌外，所有样本的16sRNA均呈阴性。（5）核酸：是否具有核酸，是纳米细菌是否为微生物的一个争议重点。Kajande等［1］用Hoechst33258对纳米细菌DNA进行染色，将浓度由0.5ml提高至5ml，在荧光显微镜下见特征性的荧光，由此认为纳米细菌存在DNA。但是Raoult［7］应用hoechst 33258进行DNA染色，结果显示不着色，从而认为纳米细菌不存在核酸。Miller等［8］将DNA探针放入纳米细菌匀浆，结果提示纳米细菌存在核酸。（6）单克隆抗体：单克隆抗体的特异性也受到质疑，Martel和Young［9］报道，认为这些抗体能与人类和牛血清白蛋白（BSA）起反应，因此不能作为一个活的微生物的特异性标志物。Hiromi Kumon［10］等也提出了一些NB的单克隆抗体，研究显示所有的IgG类抗体对各种已知的蛋白质显示出特异性，也包括BSA。

2　纳米细菌与疾病

2.1纳米细菌的细胞毒性和致病机制 现有研究认为纳米细菌具有细胞毒性，能感染细胞和组织，分泌钙化脂多糖生物膜，使细胞内外发生钙化，并分泌一些细胞毒素及细胞因子，引起感染组织的炎症反应，伴炎症因子的趋化与释放，最终导致细胞的空泡样变性、溶解或凋亡。于澄钒等［11］将NB与肾小管上皮细胞共培养，观察到大量细胞胞体膨胀增大，胞核及胞浆松散，部分胞膜溶解或核仁不可见，少数细胞胞浆内可见空泡样变。Zhang MJ等［12］将NB和人工合成的纳米羟基磷灰石（nHAPs）分别作用于MDA-MB-231人乳腺癌细胞，观察到NB和nHAPs都会降低癌细胞活性，促进癌细胞凋亡，但是NB的作用明显强于nHAPs，可能是源于NB能产生有毒的代谢物或其蛋白质成分。

2.2纳米细菌与病理性钙化疾病 目前的研究认为纳米细菌在疾病的发生发展过程中起重要作用，尤与病理性钙化的关系密切。1998年Kajander等［1］对肾结石与NB关系进行研究，开启了NB与疾病研究的先河，认为NB是作为结石核心而起作用，类似于幽门螺杆菌。

近年来研究认为纳米细菌是血管病理性钙化的一个潜在原因，研究主要集中在二尖瓣环钙化［13］、冠状动脉钙化［14］、

动脉粥样硬化［15］等。胆结石的形成是多因素作用的结果，主要包括细菌感染、脂代谢紊乱、胆囊动力学紊乱、致石基因与遗传等方面。而胆汁纳米细菌感染与胆囊结石的发生有关。张雷等［16］将胆汁中培养出的纳米细菌与大肠杆菌进行共培养，并进行茜素红钙染色，发现共培养组的钙染色呈桔红色，而普通大肠杆菌呈淡红色，认为纳米细菌通过直接附着和侵入大肠杆菌的方式引起大肠杆菌发生生物矿化作用。王利明［17］将一定量的纳米细菌注射到兔子胆囊中，作用2周后，可见胆囊中形成结石（15/20），与对照组差异显著（2/10）。通过红外光谱定性分析，归类为黑色素结石。刘亚楠等［18］将纳米细菌感染日本大耳白兔，显示有胆结石形成，其结果与王利民等的研究一致。此外，纳米细菌与胎盘钙化［19］、牙结石［20］等关系密切。

2.3针对纳米细菌的治疗 抗纳米细菌疗法：由乙二胺四乙酸（EDTA）和四环素组成，其机制为EDTA先溶解纳米细菌的钙化外壳，再发挥四环素的穿透杀菌作用。有研究表明抗纳米细菌治疗，能有效改善冠脉的狭窄程度，缓解心绞痛症状。袁宇峰［21］等将该疗法应用于Ⅲ型前列腺炎，经过为期3个月的治疗患者的纳米细菌阳性率、前列腺液卵磷脂小体及NIH-CPSI评分均较治疗前有明显改善。明爱民等［22］研究认为四环素可作为纳米细菌感染的Ⅲ型前列腺炎效果显著，可作为一线药物。

3　研究展望

未来的研究可从以下几个方面展开：（1）继续完善其DNA 序列的提取，扩大纳米细菌样本的研究。（2）由于纳米细菌的培养周期长，不利于对纳米细菌进行研究，应进一步探索其培养方法。（3）纳米细菌的致病机制有待进一步研究，根据其细胞毒性，可以用于化疗等方面。（4）寻求更直接、准确的检测方法，运用于临床检验。（5）抗纳米细菌疗法来预防、治疗结石相关疾病。

1 Kajander EO，Ciftcioglu N.Nanobacteria：an alternative mechanism for pathogenic intra-and exter-cellular calcification and stone formation. Proc NatlAcadSci，1998，95（14）：8274-8279.

2 郭亚楠，张德纯，陆合，等.纳米细菌的分离培养和保存方法探讨，中国微生态学杂志，2011，23（11），994～996.

3 郭桂林.聚合酶链反应法检测肝病患者血中纳米细菌的价值评估，国际检验医学杂志，2013，34（16），2158～2159.

4 Glass JI， Assad-Garcia N， Alperovich N， et al. Essential genes of a minimal bacterium. Proc Natl Acad Sci U S A， 2006，103（2）：425～430

5 Barba I， Villacorta E， Bratos-Perez MA，et al.Aortic valve～derived calcifyng nanoparticles： no evidence of life.Rev Esp Cardiol （Engl Ed），2012 ，65（9）：813～8.

6 Martel J1， Peng HH， Young D.Of nanobacteria， nanoparticles， biofilms and their role in health and disease： facts， fancy and future. Nanomedicine（Lond）， 2014 ，9（4）：483～99.

7 Raoult D， Drancourt M ， Azza S.Nanobacteria are mineralo fetuin complexes.PLoS Pathog， 2008，4（2）：e41.

8 Miller VM， Rodgers G， Charlesworth JA， et al.Evidence of nanobacteriallike structures in calcified human arteries and cardiac valves. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004， 287 （3）：H1115～1124.

9 Martel J， Young JD. Purported nanobacteria in human blood as calcium carbonate nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA ，2008，105（14）：5549～5554.

10 Hiromi Kumon，Akira Matsumoto，Shinya Uehara.Detection and isolation of nanobacteria-like particles from urinary stones： Long-withheld data. Issue International Journal of Urology， 2011， 18（6）： 458～465.

11 于澄钒，黄晓波，陈亮，等.纳米细菌对肾小管上皮细胞的损伤及晶体滞留的影响.北京大学学报：医学版，2010，42（4）：436～442.

12 Zhang MJ1， Liu SN1， Xu G.Cytotoxicity and apoptosis induced by nanobacteria in human breast cancer cells.Int J Nanomedicine， 2014（9）：265～71.

13 Candemir B ， Ertas FS ， Kaya CT ， et al.Association between antibodies against calcifying nanoparticles and mitral annular calcification.J Heart Valve Dis， 2010， 19（6）：745～52.

14 Tulunay Kaya C ， Sinan Ertas F ， Hasan T .Anticalcifying nanoparticle antibody titer is an independent risk factor for coronary artery calcification. Coron Artery Dis， 2011， 22（6）：394～400.

15 Cenizo Revuelta N， Gonzalez-Fajardo JA， Bratos MA.Role of Calcifying Nanoparticle in the Development of Hyperplasia and Vascular Calcification in an Animal Model.Eur J Vasc Endovasc Surg，2014， 47（6）：640～646.

16 张雷.纳米细菌对人胆囊结石形成的影响和机制探讨.中南大学，2008.

17 王利明，胆汁纳米细菌感染可致实验动物形成黑色胆囊结石.中国科技成果，2009，13（27）：54.

18 刘亚楠，张国彬，马立人，纳米细菌致兔胆囊结石的研究，华北煤炭医学院学报，2011，13（4）：461～463.

19 刘胜男，张德纯，张名均，等.钙化胎盘及脐带血中纳米细菌的形态学观察.临床检验杂志，2013，3（31）：215～217.

20 张松梅，田菲，李静，等.对纳米细菌在牙结石形成过程中的作用的初步研究.中国微生态学杂志， 2009，21（2）：152～155.

21 袁宇峰，唐吉元，沈学成，等.108例纳米细菌感染致Ⅲ型前列腺炎的诊断和治疗，局解手术学杂志，2011，02.

22 明爱民，张新际，郭君毅，等.四环素治疗纳米细菌感染的Ⅲ型前列腺炎疗效观察. 新乡医学院学报，2014，（2）.

杭州市卫生局重点项目（2010z008）

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