蛋白酶激活受体2在皮肤色素沉着中的研究进展

范勇杰， 薛春雨

蛋白酶激活受体2在皮肤色素沉着中的研究进展

范勇杰， 薛春雨

蛋白酶激活受体2； 角质形成细胞； 黑素小体； 色素沉着

1 概述

蛋白酶激活受体2(protease-activated receptor-2， PAR-2)是一条7次跨膜的单链G蛋白偶联受体，分子量40 KDa，是蛋白酶激活受体超家族四成员之一(PAR-1、PAR-2、PAR-3、PAR-4)，其表达于全身各组织，如消化系统、呼吸系统、眼的上皮细胞、心血管系统内皮细胞、皮肤角质形成细胞、平滑肌细胞等细胞的胞膜，对肠道分泌、肿瘤表达、细胞吞噬、皮肤过敏、组织修复等起着重要的作用[1-2]。1994年，S Nystedt首先通过筛选鼠基因组文库，发现了一种在结构上与PAR-1相似的受体，将其命名为PAR-2。1995年，RJ Santulli等发现，在人的表皮角质形成细胞的细胞膜上存在PAR-2，它在激活PAR-2激动剂中，主要是以胰蛋白酶为主的丝氨酸蛋白酶类。其原理：PAR-2在N端中34位Arg和35位Ser之间进行酶切，并显露新的N端，产生“系锁配体”，其与自身胞外第二环特异性的保守序列结合而被激活，通过G蛋白偶联的方式，激活下游信号传导通路，发挥功能和作用，且此水解的过程是不可逆的，以系锁配体为模板合成的人工多肽，亦能激活PAR-2，如鼠源性SLIGRL、人源性SLIGkv[3]。PAR-2激活后，通过G蛋白偶联，激活了磷脂酶C，产生了二酰甘油和三磷酸肌醇，使钙离子动员(Ca2+mobilization)加强，蛋白激酶C通路激活。2000年，M Seiberg首次发现在皮肤表皮中，PAR-2只在角质形成细胞中表达，而不在黑色素细胞中表达。在角质形成细胞中，PAR-2以ρ依赖的方式介导角质形成细胞，其内部发生细胞骨架重排：钙离子动员加强，增加肌动蛋白的聚合作用和α-辅肌动蛋白的重组，使细胞表面形态改变，且可溶性蛋白活性增加[4]。皮肤色素沉着，主要由黑色素含量来决定，色素沉着过程就是黑色素合成、转移、代谢的过程。黑色素由表皮细胞中的黑色素细胞，经一系列复杂而精确地反应生成优黑素或褐黑素，并被包裹在黑素小体内迁移至黑色素细胞突触末端[5-6]。目前，黑色素进入角质形成细胞的机制有4种，而角质形成细胞吞噬黑色素小体被认为是明确存在的。目前的研究还发现，参与黑色素传递的有关蛋白主要有PAR-2、Rab27a 和Rab11b，其中研究明确的是PAR-2[7-9]。黑色素进入角质形成细胞后，其转移至细胞核上端而发挥屏障作用，使细胞核DNA免受紫外线的损伤，发生突变[10-11]。

2 PAR-2在细胞实验方面

2001年，M Seiberg将角质形成细胞和黑色素细胞采用三维双相共培养，使激活PAR-2后的角质形成细胞黑色素含量增加；检测酪氨酸酶的mRNA并没有增加，而PAR-2的mRNA增加，提示角质形成细胞中黑色素的增加与黑色素的转运有关，与黑色素合成无关。2003年，G Scott发现角质形成细胞的细胞膜上，PAR-2能促进其分泌前列腺素E2 和前列腺素F2a，同时作用于黑色素细胞，使黑色素合成增加，细胞树突化加强，吞噬功能增加。Ando 等[12]将色素小球加入到人皮肤角质形成细胞的培养液中，24 h后角质形成细胞达到对数生长期，并在扫描电子显微镜下观察到平状和球状的角质形成细胞；发现球状角质形成细胞生成多个直径约80 nm的微绒毛，将色素小球捕获。同时，在培养液中加入PAR-2大豆胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor， STI)，使球状角质形成细胞捕获色素小体受到抑制，提示角质形成细胞摄取黑色素依赖于PAR-2的激活。2012年，L Tang等在新生儿包皮培养的角质形成细胞与黑色素细胞共培养环境中，加入0.3 mmol浓度的氧化物质H2O2，4 h后发现角质形成细胞中黑色素量增加，通过Western-blot检测发现角质形成细胞PAR-2表达增加。Choi等[13]将MNT-1黑色素瘤细胞中分离的黑色素小体置入,使用钙离子诱导分化不同时间段的SV40T人角质形成细胞，通过Masson-Fontana黑色素染色法发现，角质形成细胞摄取了其中的黑色素小体，使用Western-blot和流式细胞技术检测发现，黑色素小体在分化与未分化的角质形成细胞中均有分布，并且分化的角质形成细胞较未分化的角质形成细胞吞噬更多的黑色素小体；而加入PAR-2抑制剂STI，则有效地抑制了分化与未分化的角质形成细胞对黑色素小体的吞噬，说明角质形成细胞吞噬黑色素小体与细胞表面的PAR-2息息相关，且分化的角质形成细胞吞噬能力更强 。2011年，A Enomoto等在人角质形成细胞系HaCaT加入肉豆蔻木酚素后发现PAR-2的mRNA和蛋白表达量下降，证实了肉豆蔻木酚素可抑制PAR-2在角质形成细胞中的表达，从而减少黑色素的转运[14]。

3 PAR-2在动物实验方面的研究

2001年，C Paine等对黑皮肤的犹加敦猪选用1%、5%、10%STI涂抹局部皮肤2次/d，共8～9周，在第4～5周时即可肉眼发现其皮肤变白，并呈浓度线性相关，即浓度越高，变白越明显。2008年，CB Lin 等将PAR- 2 的激活剂SIGR和SLIGRL 涂抹在移植于联合免疫缺陷小鼠的人皮片和犹加敦猪的局部皮肤上，浓度均选择为250 μmol/L，2次/d，对移植的人皮片涂抹共5～6周，对犹加敦猪涂抹8周，两者均能显著增加移植皮片和猪皮肤色素沉着。而SIGR与SLIGRL又有不同，其并非通过钙动员加强来增加角质形成细胞而吞噬黑色素，也未通过cAMP、NF-kB等途径，但两者都通过激活PAR-2介导ρ活性来增强细胞吞噬作用。

4 PAR-2在临床方面的研究

2004年，L Babiarz-Magee 等通过研究21个正常人体皮肤样本，采用Masson-Fontana黑色素染色法将其分为白、半白、黑3组，通过免疫组化观察其PAR-2的表达，发现黑色素含量高的皮肤样本中，PAR-2表达亦较高，并且PAR-2的激活剂胰蛋白酶表达也较黑色素含量低者为高。2000年，JF Hermanns 等在对42例男性面部或额部出现色素沉着的部位使用大豆提取物(主要成分为PAR-2抑制剂STI)，3周后通过内置显微摄像机观察，发现皮肤明显变白。Moretti 等[15]通过观察23个白色人种白癜风活动期皮肤病损的角质形成细胞，发现PAR-2的表达明显较正常皮肤中表达少。研究还发现，人掌跖部的皮肤颜色较非掌跖部白，原因是掌跖部真皮成纤维细胞合成Wnt/β-连环蛋白信号途径抑制了因子DKK1，从而使掌跖部角质形成细胞的PAR-2表达下调，致使角质形成细胞吞噬黑色素下降，使其皮肤颜色较正常白[16]。

5 总结

目前研究发现，直接或间接参与调节皮肤颜色的基因超过150多种。其研究主要在黑色素合成以及与此相关的基因、酶类、内环境细胞因子调节等方面，如黑色素合成的基因调控位点、初期关键限速酶-酪氨酸酶和黑皮质素-1受体、多巴色素异构酶等[17-19]。PAR-2作为介导角质形成细胞，对黑素小体吞噬作用，以及参与黑色素的转运，目前这一研究结果已经非常明确，且研究正进一步深入，这为我们如何治疗因各种生理、病理引起的色素沉着提供了新的思路。从抑制黑色素传递这一环节考虑，研究减少黑色素向角质形成细胞传递的临床药物，可作为一种新的治疗方法。

[1] Scott G, Deng A, Rodriguez-Burford C, et al. Protease-activated receptor 2, a receptor involved in melanosome transfer, is upregulated in human skin by ultraviolet irradiation[J]. J Invest Dermatol, 2001,117(6):1412-1420.

[2] Maeda S, Maeda S, Ohno K, et al. Protease-activated receptor-2 induces proinflammatory cytokine and chemokine gene expression in canine keratinocytes[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2013,153(1-2):17-25.

[3] Ossovskaya VS, Bunnett NW. Protease-activated receptors: contribution to physiology and disease[J]. Physiol Rev, 2004,84(2):579-621.

[4] Sharlow ER, Paine CS, Babiarz L, et al. The protease-activated receptor-2 upregulates keratinocyte phagocytosis[J]. J Cell Sci, 2000,113( Pt 17):3093-3101.

[5] Yamaguchi Y, Hearing VJ. Melanocytes and their diseases[J]. Cold Spring Harb Perspect Med, 2014 May 1.

[6] Singh S, Malhotra AG, Pandey A, et al. Computational model for pathway reconstruction to unravel the evolutionary significance of melanin synthesis[J]. Bioinformation, 2013,9(2):94-100.

[7] Tang L, Li J, Lin X, et al. Oxidation levels differentially impact melanocytes: Low versus high concentration of hydrogen peroxide promotes melanin synthesis and melanosome transfer[J]. Dermatology, 2012,224(2):145-153.

[8] Tarafder AK, Bolasco G, Correia MS, et al. Rab11b mediates melanin transfer between donor melanocytes and acceptor keratinocytes via coupled exo/endocytosis [J]. J Invest Dermatol, 2014,134(4):1056-1066.

[9] Wu X, Hammer JA. Melanosome transfer: It is best to give and receive[J]. Curr Opin Cell Biol, 2014,29:1-7.

[10] Coelho SG, Yin L, Smuda C, et al. Photobiological implications of melanin photoprotection after UVB-induced tanning of human skin but not UVA-induced tanning[J]. Pigment Cell Melanoma Res, 2014 Nov 21.

[11] Nasti TH, Timares L. Mc1r, eumelanin and pheomelanin: their role in determining the susceptibility to skin cancer[J]. Photochem Photobiol, 2015,91(1):188-200.

[12] Ando H, Niki Y, Ito M, et al. Melanosomes are transferred from melanocytes to keratinocytes through the processes of packaging, release, uptake, and dispersion[J]. J Invest Dermatol, 2012,132(4):1222-1229.

[13] Choi HI, Sohn KC, Hong DK, et al. Melanosome uptake is associated with the proliferation and differentiation of keratinocytes[J]. Arch Dermatol Res, 2014,306(1):59-66.

[14] Choi EJ, Kang YG, Kim J, et al. Macelignan inhibits melanosome transfer mediated by protease-activated receptor-2 in keratinocytes[J]. Biol Pharm Bull, 2011,34(5):748-754.

[15] Moretti S, Nassini R, Prignano F, et al. Protease-activated receptor-2 downregulation is associated to vitiligo lesions[J]. Pigment Cell Melanoma Res, 2009,22(3):335-338.

[16] Yamaguchi Y, Morita A, Maeda A, et al. Regulation of skin pigmentation and thickness by dickkopf 1 (DKK1)[J]. J Investig Dermatol Symp Proc, 2009,14(1):73-75.

[17] Feller L, Chandran R, Kramer B, et al. Melanocyte biology and function with reference to oral melanin hyperpigmentation in HIV-seropositive subjects [J]. AIDS Res Hum Retroviruses, 2014,30(9):837-843.

[18] Yun CY, You ST, Kim JH, et al. P21-activated kinase 4 critically regulates melanogenesis via activation of the creb/mitf and beta-catenin/mitf pathways[J]. J Invest Dermatol, 2015 Jan 5.

[19] Wolnicka-Glubisz A, Strickland FM, Wielgus A, et al. A melanin-independent interaction between Mc1r and Met signaling pathways is required for HGF-dependent melanoma[J]. Int J Cancer, 2015,136(4):752-760.

200433 上海，第二军医大学长海医院 整形外科

范勇杰 (1986-)，男，浙江湖州人，硕士研究生.

薛春雨，200433,第二军医大学长海医院 整形外科，电子信箱：xcyfun@sina.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.05.019

2015-01-20)