正交设计法筛选玉蕈菌丝体液体培养基

王国正，郭成金，马欣燕 (天津师范大学生命科学学院，天津 300387 )

正交设计法筛选玉蕈菌丝体液体培养基

王国正，郭成金*，马欣燕 (天津师范大学生命科学学院，天津 300387 )

[目的] 筛选适宜玉蕈菌丝体生长的液体培养基。[目的]以菌丝体生物量为主要指标，采用单因素方法筛选菌丝体生长最佳碳氮源，再进行正交试验筛选其碳源与氮源最佳配比，进一步采用单因素方法筛选其最佳无机盐及VB1浓度配比。[结果]玉蕈菌丝体最佳液体培养基为麦芽糖30 g/L，蔗糖30 g/L，酵母粉3 g/L，麦麸10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，VB19.0 mg/L，pH自然。25 ℃培养288 h，其菌丝体生物量干重可达10.394 g/L。[结论]该研究为玉蕈菌丝体深层发酵生产及其液体菌种的生产与应用提供技术支持。

玉蕈；液体培养基；菌丝体；生物量；单因素；正交设计

玉蕈[Hypsizigusmarmoreus(Peck) Bigelw]又名斑玉蕈，隶属于离褶伞科(Lyophyllaceae)玉蕈属(Hypsizigusmarmoreus)[1]。玉蕈又称为蟹味菇、真姬菇、胶玉蘑、鸿喜菇、海鲜菇、松茸菇、灵芝菇、偏耳等[2]，是一种大型木质腐生真菌。玉蕈是一种生长在北温带的大型食用蕈菌，自然分布在北美、欧洲、西伯利亚和日本等地区。20世纪80年代中期由日本引入我国辽宁、福建、山西等省[3]。

玉蕈的营养成分丰富，含有多种生物活性物质，是一种低热量、高蛋白、低脂肪的保健食品。目前，已经在河北、河南、山东、山西、上海和福建等省(市)进行了推广栽培[3]，并实现了较大规模的工厂化生产[4]。玉蕈菌丝生长速度较其他蕈菌慢，培育时间长[5]。目前，对玉蕈菌丝体液体培养条件的筛选研究较少。笔者采用正交试验方法，对玉蕈所需各营养成分进行了探究，为玉蕈菌丝体深层发酵生产及其液体菌种的生产与应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试菌种供试玉蕈，由天津师范大学蕈菌研究所提供。

1.2 试验试剂试验试剂为蔗糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、酵母粉、蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、MgSO4·7H2O、KH2PO4、VB1、琼脂(天津市珠江卫生材料厂)，以上除注明外均购于生工生物，试剂均为分析纯。马铃薯、麦麸为市售。

1.3 仪器与设备YXQG02手提式压力蒸汽消毒器(山东新华医疗器械厂)；SW-CJ-1FD洁净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)；BS224S电子分析天平(Sartorius)；LRH-150-G光照培养箱(广东省医疗器械厂)；AP-01D 真空泵(天津奥特塞恩斯仪器有限公司)；DHG-9240电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.4 培养基

1.4.1PDA综合培养基。马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、KH2PO43 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、VB14.0 mg/L、琼脂20 g/L。

1.4.2碳源初筛培养基。酵母粉3 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，VB110.0 mg/L。分别以马铃薯200 g/L、蔗糖20 g/L、葡萄糖20 g/L、乳糖20 g/L、麦芽糖200 g/L为供试碳源。

1.4.3氮源初筛培养基。蔗糖20 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，VB110.0 mg/L。分别以麦麸30 g/L、酵母粉3 g/L、蛋白胨3 g/L、硫酸铵3 g/L、硝酸铵3 g/L为供试氮源。

1.5 试验方法

1.5.1菌种活化及菌丝体液体培养。将菌种提前活化后接种于PDA培养基平板上，25 ℃暗培养14 d。从平板中选取生长健壮的菌丝体前端，挑取0.5 cm2的菌种接种块，接种于广口锥形瓶液体培养基中，每瓶5块。25 ℃静置暗培养120 h，之后放入旋转式摇床中培养，摇床转速110 r/min，温度25 ℃，继续培养168 h。每个水平3次重复。

1.5.2菌丝体干重测定。将培养288 h的玉蕈菌丝体进行抽滤，80 ℃烘干至恒重，称量菌丝体干重并记录。

1.5.3碳、氮源培养基正交试验。根据碳氮源单因素初筛的试验结果，从中各选取2个较好的碳氮源，按L9(34)设计4因素3水平正交试验复筛，与KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，VB110.0 mg/L组成9个试验配方，筛选出最佳碳氮源组合。正交因素与水平如表1所示。9个试验配方如表2所示。

表1 正交试验因素和水平 g/L

表2 碳氮源正交试验设计 g/L

1.5.4无机盐及维生素水平试验。根据上述碳氮源正交试验结果，筛选出最佳的碳氮源组合作为基础培养基，再加入不同浓度梯度的KH2PO4，MgSO4·7H2O和VB1，组成无机盐和维生素的单因素培养基。无机盐和VB1因素水平试验设计如表3。

表3 无机盐和VB1因素水平试验设计

1.5.5培养基筛选验证试验。对上述各成分筛选结果进行整理综合，配成目标培养基，验证试验结果。

2 结果与分析

2.1 玉蕈菌丝体对碳源的利用碳源是蕈菌培养基的基本组成成分，为其合成胞内结构和各种代谢产物以及储藏物质提供原料，也是某些大分子物质的主要结构骨架[6]。从表4可知，玉蕈既可以利用单糖和双糖，又可以利用多糖。其中以麦芽糖最好，乳糖最差。经统计学方差分析F值是5.401，小于F4，10，0.01=5.994，大于F4，10，0.05=3.478[7]，说明不同的碳源对玉蕈菌丝体生物量的影响在0.01水平上差异不显著，在0.05水平上差异显著。应用Duncan’s检测法分析表明在0.05水平上5种碳源中的葡萄糖和乳糖之间差异不显著，马铃薯和蔗糖之间差异不显著，但2组与麦芽糖之间差异显著。为获得最佳碳源配方，最终选取麦芽糖和蔗糖作为碳源进行正交试验。

表4 不同碳源对玉蕈菌丝体生物量的影响

2.2 玉蕈菌丝体对氮源的利用氮源是微生物不可缺少的营养元素，为核酸、蛋白质和各种酶类的合成提供原料[8]。从表5可知，玉蕈既可以利用有机氮源，也可以利用无机氮源。其中以酵母粉最佳，硫酸铵最差。可见玉蕈优先利用有机氮源。经统计学方差分析表明F值是28.433，大于F4，10，0.01=5.994[7]，说明不同氮源对玉蕈菌丝体生物量的影响在0.01水平上差异极显著。应用Duncan’s检测法分析表明在0.01水平上麦麸和蛋白胨之间差异不显著，但和酵母粉、硫酸铵、硝酸铵之间差异显著。为获得最佳氮源配方，最终选择酵母粉和麦麸作为氮源进行正交试验。

表5 不同氮源对玉蕈菌丝体生物量的影响

2.3 碳氮源正交试验结果由L9(34)正交试验结果(表6)表明，在4个因素中，麦芽糖的极差(R)最大，麦麸的极差最小。极差越大，表明该因素的变化对试验结果的影响程度越大[9]。因此麦芽糖对玉蕈菌丝体生物量的影响最大，麦麸影响最小。4个因素中各自的3个不同水平使得平均值(K)也不同，即K1、K2和K3，同一因素下K值越大表明在该水平上培养条件越好。比较各因素下不同水平的K值得到，麦芽糖、蔗糖和酵母粉在第3个水平上，麦麸在第1个水平上，玉蕈菌丝体长势最好，生物量最高，因此玉蕈菌丝体液体培养基的碳、氮源最佳配方是A3B3C3D1，即麦芽糖30 g/L，蔗糖30 g/L，酵母粉3 g/L，麦麸10 g/L。

表6 碳氮源正交直观分析 g/L

2.4 无机盐及VB1浓度对玉蕈菌丝体生物量的影响无机盐和VB1是微生物生长所必需的营养物质，但所需量很少，对蕈菌菌丝体生物量的影响程度不及碳源和氮源。无机盐提供了细胞物质合成的主要元素，对新陈代谢起着重要的调节作用，浓度过高或过低都会影响新陈代谢[10]。VB1是辅酶的组成成分或发挥辅酶的作用，对蕈菌的代谢活动起到调节作用。经统计学分析F值是2.238，小于F3，8，0.05=4.066[7]，说明不同浓度的无机盐和VB1对玉蕈菌丝体生物量的影响在0.05水平上差异不显著。此时可考虑各组生物量的均值，由表7可知，无机盐和VB1的最佳配比是处理①，即KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，VB19.0 mg/L。

表7 无机盐及VB1浓度对玉蕈菌丝体生物量的影响

2.5 培养基验证结果按照上述试验结果配置培养基(麦芽糖30 g/L，蔗糖30 g/L，酵母粉3 g/L，麦麸10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，VB19.0 mg/L，pH自然)，接种，25 ℃静置暗培养120 h，之后放入旋转式摇床中培养，摇床转速110 r/min，温度25 ℃，继续培养168 h。抽滤烘干至恒重，玉蕈菌丝体生物量干重可达10.394 g/L，基本大于试验中所测菌丝体生物量，因此该培养基是最佳培养条件。

3 结论

(1)试验发现，接种后，菌块浮于培养基表面，培养基浑浊(图1a)；静置暗培养120 h后，菌块周围及培养基中出现絮状菌丝，培养基较浑浊(图1b)；摇床培养168 h后培养基澄清，出现大小不等的菌丝体球，且菌丝体贴壁生长(图1c)。

(2)试验结果表明，玉蕈最佳液体培养基为麦芽糖30 g/L，蔗糖30 g/L，酵母粉3 g/L，麦麸10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，VB19.0 mg/L，pH自然。25 ℃静置暗培养120 h，之后放入旋转式摇床中培养，摇床转速110 r/min，温度25 ℃，继续培养168 h，玉蕈菌丝体生物量干重可达10.394 g/L。

[1] 郭成金.蕈菌生物学[M].北京:科学出版社, 2014: 203.

[2] 黄年来.栽培真姬菇的日本技术[J].中国食用菌, 2000，19(6): 27-29.

[3] 郝春喜.蟹味菇子实体呈鲜味物质氨基酸的提取、分离纯化研究[D].长春：吉林农业大学, 2012.

[4] 刘明广,杨素红,张新红,等.斑玉蕈工厂化瓶栽技术[J].北方园艺, 2014(1): 146-147.

[5] 刘振伟,史秀娟,马强.真姬菇的特性及其栽培技术[J].中国果菜, 2001(4): 15.

[6] 邢来君,李明春.普通真菌学[M].北京:高等教育出版社, 1999: 50-58.

[7] 杜荣骞.生物统计学[M].北京:高等教育出版社, 2003: 263-265.

[8] 刘成荣.碳源、氮源及其比例对香菇液体深层培养的影响[J].德州学院学报, 2007, 23(6): 58-60.

[9] 刘西周,郭成金.采用L9(34)正交设计方法筛选血耳菌丝体液体培养基[J].中国食用菌, 2009,28(1): 36-38.

[10] 陈娟.蕈菌液体培养参数优化及接种装置研究[D].南京:江苏大学, 2006.

Selection on Liquid Culture Medium for Mycelium ofHypsizigusmarmoreus(Peck) Bigelw by Orthogonal Design

WANG Guo-zheng，GUO Cheng-jin*，MA Xin-yan

(College of Life Science，Tianjin Normal University，Tianjin 300387)

[Objective] In order to select the optimal liquid medium suitable for mycelium ofHypsizigusmarmoreus(Peck) Bigelw .[Method] Adopting mycelial biomass ofHypsizigusmarmoreus(Peck) Bigelw as major index, firstly the optimum carbon and nitrogen source ofHypsizigusmarmoreus(Peck) Bigelw were used in the single factor test, and then carrying out the orthogonal test for the different concentrations of carbon and nitrogen source. Further, filtrating the optimum inorganic salt and VB1were used in the single factor test. [Result] The test result showed that the optimum liquid medium of mycelium composition ofHypsizigusmarmoreus(Peck) Bigelw were maltose 30 g/L,sucrose 30 g/L, yeast extract 3 g/L, wheat bran 10 g/L, KH2PO41 g/L, MgSO4·7H2O 0.5 g/L, VB19.0 mg/L, natural pH. Culturing for 288 hours at 25 ℃. The mycelial biomass dry weight ofHypsizigusmarmoreus(Peck) Bigelw reached 10.394 g/L.[Conclusion] It provided technical support for the deep fermentation ofHypsizigusmarmoreus(Peck) Bigelw mycelium and the production and application of liquid spawn.

Hypsizigusmarmoreus(Peck) Bigelw; Liquid culture media; Mycelium; Biomass; Single factor; Orthogonal design

王国正(1990-)，男，河北唐山人，硕士研究生，研究方向：蕈菌生物学。*通讯作者，教授，硕士生导师，从事植物细胞营养及蕈菌生物学研究。

2015-03-25

S 646；Q93-335

A

0517-6611(2015)14-042-03